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研究背景痴呆是指慢性获得性进行性智能障碍综合征。以缓慢出现的智能减退和不同程度的人格改变为主要特征,痴呆是65岁以上老龄人群中常见的疾病,截至2015年,全世界约有4,700万人患有痴呆,预计到2050年患病人数将增长至1.3亿。但是对于痴呆的发病机制目前仍然不是很清楚,伴随着世界老龄化的加速,痴呆的患病人数将进一步增加,因此对痴呆发病机制的研究显得尤为重要。近些年来有研究表明ADD3基因的突变和痴呆有关,ADD3基因所表达的蛋白是内收蛋白,在细胞内,内收蛋白的主要作用是结合在丝状肌动蛋白快速生长末端,从而维持肌动蛋白的聚合状态。肌动蛋白的聚合状态是微循环血管平滑肌细胞收缩功能的结构基础,而微循环功能异常是痴呆的重要原因,但是肌动蛋白聚合改变是否参与痴呆形成,目前尚不清楚,国内外相关研究也甚少。因此,根据国内外相关研究进展,我们提出假说:肌动蛋白聚合障碍导致血管平滑肌细胞收缩功能受损,继而导致微循环功能异常,脑血流自调节受损,并引起内皮细胞损伤、血脑屏障渗漏、炎性渗出和神经元凋亡,并最终形成痴呆。目的(1)在分子水平,研究肌动蛋白聚合和解聚的变化对血管平滑肌细胞内丝状F-肌动蛋白(F-actin)和单体G-肌动蛋白(G-actin)的含量和比率的影响。(2)在细胞水平,研究肌动蛋白聚合和解聚的变化对血管平滑肌细胞收缩功能的影响。(3)在体外水平,研究肌动蛋白聚合障碍对大鼠微循环在压力诱导下的肌源性收缩功能的影响。(4)在动物水平,研究肌动蛋白的聚合障碍对大鼠空间记忆和学习能力的影响。(5)尝试探讨肌动蛋白聚合障碍在脑微循环功能异常所致痴呆中可能的作用机制。方法(1)免疫组化实验:用鼠源血管平滑肌细胞系进行细胞培养,然后将细胞种植于6孔培养板中,培养板每个孔的底部有可供细胞贴附生长的玻片,用溶剂二甲基亚砜(DMSO)以及溶解于DMSO的细胞松弛素D(Cyt-D)和Jasplakinolied(JK)分别处理血管平滑肌细胞,然后进行F-actin、G-actin的染色并制成玻片。最后用荧光显微镜拍照并对F-actin和G-actin进行定量。(2)细胞收缩实验:用鼠源血管平滑肌细胞系进行细胞培养,然后将其和胶原凝胶工作液混合并种植于24孔培养板中,分别用DMSO、Cyt-D和JK处理血管平滑肌细胞,观察胶原凝胶块的收缩情况,并进行定量。(3)肌源性反应实验:把野生型大鼠和Add3基因敲除大鼠大脑中动脉的M2段安装在Living System中进行肌源性反应实验,并分别用DMSO、Cyt-D和JK处理,观察随着压力升高血管内外径变化情况。(4)动物实验:测量野生型大鼠和Add3基因敲除大鼠的体重、大脑重量、平均动脉压,看其是否有差异,并对野生型大鼠和Add3基因敲除大鼠连续四天重复进行八臂水迷宫实验,观察它们在八臂水迷宫中逃脱所花费时间的差异。结果(1)免疫组化实验:各组F-actin的标准化荧光强度都比G-actin高。Cyt-D处理组的F-actin标准化的荧光强度比对照组低,而JK处理组的比对照组高;Cyt-D处理组的G-actin标准化的荧光强度比对照组高,而JK处理组的比对照组低。Cyt-D处理组的F/G-actin比率比对照组低,而JK处理组的比对照组高。(2)细胞收缩实验:Cyt-D处理组的胶原基质收缩百分比与对照组比较小,而JK处理组胶原基质收缩百分比较对照组大。(3)肌源性反应实验:与野生型大鼠相比Add3基因敲除大鼠血管内径收缩程度明显较小,两种大鼠的血管随压力扩张百分比无明显差异。空白对照组和溶剂DMSO处理组相比,血管收缩百分比无明显差异。Cyt-D处理组与DSMO溶剂对照相比,两组大鼠的血管内径收缩百分比均减小,但野生型大鼠减小的更明显。JK处理组与DMSO溶剂对照相比,两组大鼠的血管内径收缩百分比均增加,但Add3基因敲除大鼠增加的更多。(4)动物实验:Add3基因敲除大鼠和野生型大鼠的体重、大脑重量、平均动脉压无明显差异。与野生型大鼠相比,Add3基因敲除大鼠在八臂水迷宫实验中,前两天及第三天的前两次重复实验中逃脱所花费的时间明显较长,而第三天的后两次及第四天的重复实验中,两组大鼠逃脱所花费的时间无明显差异。结论肌动蛋白通过聚合变化可以使血管平滑肌细胞内F-actin和G-actin相互转化,当G-actin向F-actin转化增加时,血管平滑肌细胞的收缩能力会增强,而当F-actin向G-actin转化增加时,血管平滑肌细胞的收缩能力会减弱。当血管平滑肌细胞收缩功能减弱时,导致脑血管对压力诱导的的肌源性收缩反应受损,并引起脑血流自调节异常,继而导致血脑屏障渗漏,炎性渗出,海马神经元损伤,并最终形成痴呆或加速痴呆的进程。