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第一部分 2’-MOE修饰反义Stat3寡核苷酸对高侵袭性人肝癌细胞的作用及其分子机制研究
本实验主旨在于研究2’-MOE修饰的反义Stat3寡核苷酸特异抑制高侵袭性人肝癌细胞系HCCLM3中Stat3表达的规律，观察其对该细胞系增殖、体外侵袭、诱导血管生成等潜能的作用，并利用cDNA微阵列技术探讨其相关的分子机制，为该药物的进一步研究奠定基础，同时为深入理解肝癌生成、进展的机制提供新的思路。
1．反义Stat3寡核苷酸特异抑制HCCLM3细胞Stat3表达的规律：
采用Lipofectamine 2000阳离子脂质体转染试剂作为载体(寡核苷酸：脂质体=1∶2(w/v))，以空白载体为对照，分别以2’-MOE修饰的反义Stat3寡核苷酸(Stat3 ASO，ISIS-113176-3)、随机序列寡核苷酸 (BRC oligon.，ISIS-29848-11)转染 HCCLM3细胞。分别应用RT-PCR、免疫细胞化学的方法检测转染细胞Stat3 mRNA以及Stat3蛋白、磷酸化Stat3(Try705)蛋白表达水平的变化。
2．反义Stat3寡核苷酸对细胞形态及超微结构的影响：
用相差显微镜以及电子显微镜观察转染Stat3 ASO或BRC oligon．细胞的形态以及超微结构，结果发现：Stat3 ASO和阳离子脂质体形成直径约300 nm的单层脂质体复合物，以胞吞方式进入细胞。Stat3 ASO能够特异地引起线粒体嵴减少。
3．反义Stat3寡核苷酸对细胞增殖、成瘤性、细胞凋亡和细胞周期的影响及其可能分子机制：
采用MTT法、裸鼠体内成瘤实验评价药物对细胞增殖、体内成瘤性的影响，流式细胞仪分析细胞周期和细胞凋亡。结果发现：Stat3 ASO以剂量依赖的方式特异抑制HCCLM3细胞的增殖，并且其抑制细胞增殖的效应在48h达到高峰；Stat3 ASO预处理(250 nM，24h)的细胞在裸鼠体内的成瘤性减弱以及增长缓慢。250 nM Stat3 ASO处理细胞24h，引起细胞周期S/G2-M期阻滞、诱导明显的细胞凋亡(43.6±1.83％)。基因芯片发现Stat3 ASO下调了细胞周期及DNA损伤修复相关的关键基因BRCA1、BRCA2、cyclin D1、p16ink4、CDC25a、cdk4，p21Waf1等，下调了与凋亡有关的基因Apaf-1、bax、bcl-2、bcl-x、survivin等，并上调 Fas(Apo-1)的表达。多基因的变化导致其上述效应。
4．反义Stat3寡核苷酸对细胞体外侵袭能力的影响及其可能分子机制：
Transwell体外侵袭实验测定发现；250 nM Stat3 ASO处理细胞24h能够特异抑制细胞体外侵袭活性。明胶酶谱法测定显示：转染细胞MMP2、MMP9 的分泌水平显著降低，Stat3 ASO特异下调HCCLM3细胞分泌MMP2、MMP9，尤其是MMP2。基因芯片结果显示：Stat3 ASO下调与侵袭转移相关的基因MMP-2、MMP-9、KISS1、Nm23-E4等，以及与粘附相关的基因Integrinα5、Integrinα 3、CD44、MUC-18、Integrin β3；并上调TIMP1。这些基因综合的影响结果导致肝癌细胞体外侵袭能力的下降。
5．反义Stat3寡核苷酸对细胞诱导血管生成能力的影响及其可能分子机制：
裸鼠皮内肿瘤血管形成试验发现：Stat3 ASO显著抑制了HCCLM3诱导血管生成的能力；RT-PCR和ELISA的方法显示：VEGF121；VEGF165；VEGF189三种VEGF同源体的表达显著下调。基因芯片进一步发现：与血管形成相关的基因如ANGPT2、EGFR、FGF2、IFNA1、IGF-1、PDGFα、thrombospondin2、VEGF等显著下调。
另外，akt-1、erb-2、MEK1、β-catenin、c-fos等基因的下调表达可能参与了上述多个过程。
综上所述，2’-MOE修饰的反义Stat3寡核苷酸特异抑制Stat3的表达，并影响多基因表达谱的改变，进而有效抑制了肝癌的生长、侵袭、血管生成能力。说明反义Stat3寡核苷酸药物是有潜力的抗肝癌治疗的药物。也从另外角度提示Stat3信号通路可能通过调控多种肿瘤发生相关基因而影响肝癌的进展。因而为肝癌分子机制的研究提供了新的思路。
第二部分 2’-MOE修饰反义Stat3寡核苷酸抑制肝癌生长和侵袭转移的体内研究
本部分研究目的在于探讨体内应用2’-MOE修饰的反义Stat3寡核苷酸对有高侵袭潜能肝癌的生长、侵袭转移的作用，评价其作为抗肝癌治疗药物的应用价值。
建立90只裸鼠原位种植HCCLM3肝癌模型，并随机平均分为两大组。各大组随机分为三实验组(n=15)，分别设为：生理盐水(NS)对照组(G1)、随机序列寡核苷酸(BRC oligon．)对照组(G2)、反义Stat3寡核苷酸(Stat3 ASO，ISIS-113176-3) 治疗组(G3)。方案一(E1)：其中一大组裸鼠于原位种植肿瘤后第2天开始治疗，E1G1组NS 0.2ml i．p．，E1G2组50mg/kg BRC oligon．ip．，E1G3组50mg/kg Stat3 ASO i．p．，均隔两天注射一次；连续注射9次后，改为隔一天注射一次，注射3次；方案二(E2)：另一大组裸鼠于种植肿瘤后第10天开始治疗，E2G1组NS 0.2ml i．p．，E2G2组50mg/kg BRC oligon．ip．，E2G3组50mg/kg Stat3 ASO i.p.，均隔一天注射一次，注射12次。最后一次给药后第三天(即第35天时)，各组随机选择9只裸鼠解剖观察肝癌生长和腹腔转移情况；免疫组化检测Stat3表达；抗小鼠CD34抗体标记肝癌血管内皮细胞，计数微血管密度(MVD)；采用连续切片法检测肺转移灶数目；ELISA法测定裸鼠血清中VEGF和bFGF的含量；常规检验血细胞分类计数以及转氨酶(AST、ALT)等。各组中另6只裸鼠继续饲养以观察生存时间。
我们获得了至少四方面有意义的结果：
1.体内应用反义Stat3寡核苷酸有效抑制肝癌的生长、侵袭转移，延长荷瘤鼠生存期：
两种用药方案，反义Stat3寡核苷酸均能够特异地抑制Stat3蛋白的表达，并有效抑制肝癌的生长、局部转移(肝内、腹腔、膈肌等)和肺转移。方案一中反义Stat3寡核苷酸治疗组(E1G3)瘤重为0.93±O.12g，明显低于生理盐水对照组(E1G1)1.73±0.17g(P<0.01)和随机序列寡核苷酸组(E1G2)1.67±0.27g(P<0.01)。E1G3组未见肺转移，而E1G1组和E1G2组肺转移率分别为100％和89％ (P<0.001)。E1G3组荷瘤裸鼠的生存期显著长于E1G1组(101±14.6天vs 49.0±4.9天，P<0.001)和E1G2组(101±14.6天 vs 52.7±6.7天，P<0.001)。方案二中反义Stat3寡核苷酸治疗组(E2G3)瘤重为1.18±0.11g，也明显低于生理盐水对照组(E2G1)1.89±0.24g(P<0.01)和随机序列寡核苷酸组(E2G2)1.77±0.39g(P<0.01)。E2G3组肺转移率为22％，而E2G1组、E2G2组的肺转移率皆为100％(P<0.01)。
2.体内应用反义Stat3寡核苷酸有效抑制肝癌血管生成：
两种治疗方案中，反义Stat3寡核苷酸均能有效抑制肝癌血管生成，E1G3组微血管密度显著低于E1G1组(3.3±1.5 vs.15.2±3.4；P<0.01)和E1G2组(3.3±1.5 vs.13.8±4.0；P<0.01)；E2G3组微血管密度也明显低于E2G1组(4.0±1.8vs.16.8±1.7：P<0.01)和E2G2组 (4.0±1.8 vs.14.5±4.0；P<0.01)。ELISA检测结果显示：反义Stat3寡核苷酸明显抑制了荷瘤裸鼠血清中VEGF和bFGF的表达水平(P<0.01)。上述结果表明：通过下调VEGF和bFGF等促血管生成因子的表达而抑制血管生成可能是反义Stat3寡核苷酸抑制肝癌在裸鼠体内生长和转移的机制之一。
3.肿瘤负荷影响反义Stat3寡核苷酸的疗效：
早期给予反义Stat3寡核苷酸治疗(E1G3组)比后期给予反义Stat3寡核苷酸治疗(E2G3组)更为有效地抑制肝癌生长(瘤重0.93±0.12g vs.1.18±0.11g；P<0.05)、肺转移(0/9 vs 2/9；P<0.05)、以及延长荷瘤鼠的生存期(101±14.6天vs.82.3±11.1天；P<0.05)，但两组在Stat3蛋白表达、血清VEGF、bFGF含量和微血管密度等方面未见明显差别。
4.体内应用反义Stat3寡核苷酸对荷瘤裸鼠的造血功能、肝脏功能无明显影响：
综上所述，2’-MOE修饰的反义Stat3寡核苷酸体内应用展示其抗肝癌生长、侵袭、血管形成的治疗价值及其能被荷瘤宿主良好耐受的特性；首次揭示肿瘤负荷影响反义寡核苷酸抗肿瘤的疗效：证实Stat3信号通路在肝癌生成、进展中有重要作用，为深入研究肝癌发生、侵袭转移机制提供新的思路。