恶性外周神经鞘瘤(Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors, MPNST)是一种相对罕见的软组织肉瘤,总发病率大约为十万分之一。MPNST分为原发型和NF1继发型,也有小部分发生于其他肿瘤的放射性治疗过程中,其中NF1继发型约占MPNST总数的50%。虽然,MPNST的发病率较低,但是其转移性强,恶性程度高;发病早期,治疗后复发率高;发病晚期,对化疗药物应答性差,且病程进展迅速,死亡率较高,5年存活率为35-50%。目前,手术切除是临床治疗MPNST的主要方法。但是,由于MPNST形态呈弥散性,边缘模糊,且侵袭和转移性强,给手术造成了极大困难。因此,迫切需要对MPNST进行靶向治疗药物的研究。论文首次对MPNST进行了广泛的、综合性的药物活性分析,筛选出对MPNST具有较高活性的化学药物,以及潜在的药物作用靶点。其次,根据药物分析结果,对MPNST中两种重要的激酶,也即重要的药物作用靶点:p21活化激酶(PAK)和Polo样激酶1 (PLK1)进行了功能和作用机制研究。第一部分MPNST的高通量药物活性分析本部分研究首先建立高通量法对一种MPNST细胞(ST8814)进行了药物活性分析,随后以高通量药物活性结果为基础,选用一个对MPNST更具有针对性的高通量药物集,包括与MPNST更加相关的小分子药物,如MEK,RAF,RAS,FTI,PAK,ERK抑制剂,以及Wnt,Hedgehog,p53,EGF,HDAC 通路中的一系列小分子抑制剂,对MPNST细胞进行了药物活性分析。同时,采用Spearman等级相关系数对分析方法和结果进行了一致性评价。最后,利用化学试剂诱导法和以上高通量药物活性分析法进一步研究了 MPNST产生MEK抑制剂耐药性后,对抗肿瘤药物的活性情况,具体研究结果如下:(1)高通量药物活性分析结果表明,MEK抑制剂、Pak抑制剂以及一些蛋白酶体抑制剂等对MPNST具有较高活性,同时发现一些尚未在MPNST中研究的药物作用靶点,如Polo样激酶,Aurora激酶,烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)等。(2)对于数据库间的一致性评价,我们测试了两种来自其他大型数据库的细胞株;对同种细胞株,采用不同检测方法:包括ATPLite法,氧化还原法或细胞核计数法测得的IC50进行了一致性评价。研究结果表明,影响一致性的因素有很多,包括细胞的培养条件,细胞存活率检测方法,药物的浓度范围,药物的储存及统计方法等,其中运用不同的计算方法是一致性的最大影响因素。(3)成功诱导一株MPNST形成MEK耐药性,且初步确认了一些在MEK抑制剂出现耐药性情况下,仍具有较高活性的药物,如Pak抑制剂,Brodomain抑制剂以及PI3K/mTOR抑制剂等。通过以上研究,我们建立了 MPNST的高通量药物活性分析平台,对MPNST细胞进行了综合性的药物活性分析,得到了对MPNST活性较高的药物,如MEK抑制剂,Pak抑制剂,PLK1抑制剂和蛋白酶体抑制剂等。利用化学诱导法成功获得MEK抑制剂耐药MPNST细胞株,并进行了药物活性分析。第二部分Pak1/2/3在MPNST中的作用及机制研究超过50%的MPNST与肿瘤抑制基因NF1的突变有关。NF1基因表达缺失导致Ras及其下游通路的激活,包括Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT /mTOR信号通路,以及Wnt/β-catenin等通路。由于Pak可以调节Ras驱动的肿瘤的发生,因此,我们Pak激酶可能也参与MPNST的信号通路。本研究中我们利用免疫组化,Western Blot等方法检测了 Pak1/2/3在恶性外周神经鞘瘤组织及细胞中的表达水平,并且通过抑制Pak1/2/3对其在MPNST中的作用机制进行了研究,结果表明,Pak1/2/3与人类恶性周围神经鞘瘤间具有很强的相关性,具体研究结果如下:(1)免疫组化,WesternBlot实验结果显示,Pak1/2/3在MPNST中的表达量显著高于正常神经细胞,且高于神经纤维瘤,说明Pakl/2/3的表达水平与MPNST的恶性程度具有相关性;(2) MTS细胞增殖实验,伤口愈合、普通Transwell小室实验以及基质胶侵袭实验结果显示,Pak抑制剂能够降低MPNST细胞的增殖、迁移和侵袭能力;对Pak在MPNST中的作用机制研究表明,Pak主要通过Raf/Mek/Erk信号通路抑制MPNST的增殖,可能通过cadherin表达调控MPNST细胞的迁移和侵袭;(3)通过转录因子分析我们发现,小分子Pak抑制剂IPA-3能够下调p53的表达,RT-PCR和荧光素酶实验结果证明,Pak可能通过调控翻译水平下调MPNST中的p53的表达;(4)化学合成非ATP竞争性小分子Pak抑制剂IPA-3及其结构类似物,并且在多种细胞中进行了活性分析,其中类似物Bis (2-naphthyl) disulfide活性明显高于IPA-3,但是需要进一步对其进行结构与功能的研究。通过以上研究,我们发现Pak1/2/3在MPNST的增殖,迁移和浸润过程具有重要作用,且其表达量可以作为MPNST恶性程度的标志。第三部分PLK1在MPNST中的作用及机制研究PLK1在细胞中有很多作用:控制有丝分裂起始点和G2/M期的检查点,协调中心体与细胞周期,调节纺锤体组装和染色体分离,在纺锤体中央区和脱落过程中发挥多种功能,以及促进DNA复制,参与细胞分裂和减数分裂等。研究证明,PLK1在人类的很多肿瘤中都具有高表达,通过抗体、干扰RNA或者激酶抑制剂阻断PLK1的表达,能够抑制肿瘤细胞的增殖以及诱导细胞凋亡。目前,PLK1在MPNST中的表达以及抑制PLK1对MPNST细胞的影响尚未有人研究。因此,论文首次对PLK1在MPNST中的作用及机制进行了研究。本研究首先通过基因芯片和Western Blot等方法检测了 PLK1在人和小鼠恶性外周神经鞘瘤组织以及细胞中的表达。其次,利用MTS细胞增殖实验,划痕实验,以及siRNA瞬时转染等体外细胞学实验,研究了 PLK1在MPNST细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。最后,我们采用移植瘤小鼠,对PLK1在体内的作用机制进行了研究,具体研究结果如下:(1)高通量药物活性分析中,PLK1抑制剂是对MPNST具有较高活性的药物之一;(2)我们通过人和小鼠的基因芯片分析发现,PLK1在MPNST中表达量显著高于神经纤维瘤和正常神经细胞;(3) MTS和伤口愈合等体外实验证明,PLK1抑制剂B16727能够降低MPNST的增殖和迁移能力,且与Aurora激酶抑制剂MLN8237有明显的协同作用;(4)体内实验证明,PLK1抑制剂能够降低小鼠MPNST移植瘤的增长速度。由于PLK1是细胞周期激酶,因此我们通过免疫组化实验对移植瘤小鼠经过BI6727治疗后的肿瘤组织切片中的细胞周期标志物进行了分析。结果显示,BI6727处理组肿瘤切片Ki67的染色细胞数明显低于对照组,说明移植瘤小鼠经过PLK1抑制剂处理后,肿瘤中活性细胞数降低;但是Cleaved Caspase 3的水平无变化,说明没有BI6727并没有诱导肿瘤细胞凋亡;BI6727对phospho-histone-3无影响,说明细胞可能发生G2-M期捕获,同时CyclinB1 (G2-M期的标志)水平升高,进一步证明BI6727能够诱导细胞发生G2-M期捕获,从而抑制细胞分裂。以上研究表明,人和小鼠MPNST中PLK1表达量显著升高,通过抑制细胞周期激酶PLK1能够使细胞发生G2-M期阻断,抑制细胞有些分裂,从而降低MPNST细胞的增殖和迁移,降低移植瘤小鼠的肿瘤增长速度。因此,PLK1可能成为MPNST治疗的新靶点。