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(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(HN)是合成降血脂药物阿托伐他汀(Atorvastatin)的关键手性中间体,同时还可用于合成L-肉毒碱、(R)4-氨基-3-羟基丁酸(GABOB)等。HN的合成方法主要分为以环氧氯丙烷、L-苹果酸等为原料的化学法和以羰基还原酶、卤醇脱卤酶、腈水解酶、脂肪酶等为催化剂的生物酶法,其中生物酶法合成HN具有反应条件温和、环境友好、选择性高及反应步骤短等优点,符合“绿色化学”的要求,因此受到广泛关注。本文围绕生物酶法催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)经(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)合成HN的工艺路线,从生物催化剂的筛选、制备、应用及产物HN的分离提取等环节展开了详细的研究和探讨。论文首先研究了酶法催化COBE合成(S)-CHBE的过程。从实验室保藏的菌株中筛选到一株对COBE具有较高催化活性及选择性的羰基还原酶(CRD)产生菌(编号为ZJB09244)和一株用于辅酶循环再生的葡萄糖脱氢酶(GDH)产生菌(编号为ZJB09251)。研究了两种酶的pH和热稳定性,发现CRD在中性或偏碱性条件下较稳定,而GDH则在中性条件下较稳定;CRD的热稳定性较好,在30 ℃、40 ℃、50 ℃下的半衰期分别为:40.3 h、13.9 h、8.0 h,GDH的热稳定性相对较差,在相同温度下的半衰期分别为:14.4 h、4.4 h、0.08 h。优化了水相中催化COBE合成(S)-CHBE的反应条件,根据底物的不同添加模式,其最佳条件分别为:a.底物一次性加入模式:COBE浓度100 mM,葡萄糖浓度 120 mM,CRD 3 g/L,GDH3 g/L,NADP+浓度 25 μmol/L,反应温度35℃,通过流加2MK2HPO4控制反应pH恒定于6.3,在此条件下反应30 min,产物(S)-CHBE的产率可达98%以上;b.底物分批补加模式:初始COBE浓度为100 mM,在30,40,60,90 min时向反应体系中加入33.3 mM的COBE,其终浓度为233.3 mM,反应温度及pH分别为35℃、pH 6.3,在此条件下,产物(S)-CHBE的产率可达92.1%,产物e.e.值均大于99%。为解决COBE的水溶性差及对其酶活较强的抑制作用,本文构建了缓冲液-有机溶剂两相体系催化COBE合成(S)-CHBE的过程。选择乙酸丁酯作为有机相,并对两相体系的催化条件进行了研究,得到了最佳反应条件:a.底物一次性加入模式:两相体积比为1:1,搅拌转速为 250 rpm,COBE 浓度为 500 mM,葡萄糖浓度 600 mM,CRD 9 g/L,GDH9g/L,NADP+浓度25 μmol/L,反应温度35。C,反应pH6.3,在此条件下,产物(S)-CHBE的产率可达95%以上,e.e.值大于99%。b.底物分批补加模式:两相体积比为1:1,搅拌转速为250 rpm,初始COBE浓度为 300 mM,在 30,40,60,90,120,150,180 min 时向反应体系中加入100 mM的底物,初始羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶用量为9 g/L,在40和90 min时分别向反应体系中加入3 g/L的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶。反应温度35℃,pH 6.3,在此条件下反应6 h,产物(S)-CHBE的产率达95.3%。在此反应条件下,2 L反应体系中的产物经萃取、减压蒸馏等操作共制得309.6 g产物样品,总收率达92.9%。在完成(S)-CHBE合成的基础上,论文研究了酶法催化(S)-CHBE合成HN的过程。从实验室保藏的菌株中筛选到了一株对(S)-CHBE具有较高催化活性的卤醇脱卤酶(HHDH)产生菌(编号为ZJB09256)。考察了该酶的pH和温度稳定性,发现该酶在pH中性或略偏酸性的条件下稳定性较好;同时该酶具有良好的热稳定性,在30℃、40 ℃、50℃、60℃、70℃下的半衰期分别为:57.7h,23.1h,12.8h,9.6h,0.24h。优化了 HHDH催化(S)-CHBE合成HN的反应条件,其最佳条件为:底物(S)-CHBE浓度100 g/L,湿菌体的用量为100 mg/gsubstrate(即10g/L),反应温度45℃,反应pH通过流加30%的NaCN溶液控制在7.7,在此条件下,产物HN的产率最高可达85%以上。论文研究了从反应液中分离提取HN的过程。选择CaCl2作为絮凝剂用于去除反应液中的菌体,并对絮凝条件进行了优化,其最佳条件是:CaCl2浓度3g/L,反应液pH调至中性或偏酸性,30-40 ℃条件下快速搅拌1 min(120 rpm),慢速搅拌5 min(80 rpm),静置30 min后真空抽滤,抽滤后样品的澄清度可达97%以上。选择乙酸乙酯作为萃取剂用于产物HN的提取,并对萃取条件进行了优化,其最佳条件为:反应液pH调节至7.0或以下,乙酸乙酯与反应液的体积比为0.75,在30 ℃下振荡萃取10 min,静置分离有机相后,在相同条件下对水相再萃取两次,总萃取率可达94.0%。利用最佳的絮凝条件和萃取条件,对800 mL反应液中的HN进行提取,最终得到62 g样品,该过程的总萃取率为96.4%,反应总收率为82.1%。论文还对三酶一锅法合成HN进行了初步研究。首先确定了加酶方式及反应过程中的控制参数:羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶首先加入反应体系,以2MK2HP04控制pH在6.3,35℃下反应,当底物COBE全部转化后,将反应温度提高至45 ℃,并以30%的NaCN调节pH至7.7,同时加入卤醇脱卤酶。在这过程中发现COBE对卤醇脱卤酶酶活有非常强烈的抑制作用,当COBE浓度低于1 mM时,随着COBE浓度的增加,酶活急速下降,当COBE浓度超过5 mM时脱卤酶完全失活,因此要实现一锅法反应必须使COBE完全转化。采用分批补加的方式可以将水相反应中COBE的浓度提高至200 mM,反应结束后HN的最高产率可以达到77.9%。考察了不同有机溶剂对脱卤酶酶活的影响,选择邻苯二甲酸二甲酯和磷酸盐缓冲液构成两相体系进行三酶一锅法反应,COBE浓度为300 mM,反应结束后体系中HN的浓度为165 mM。