胚胎多潜能干细胞包括胚胎干细胞(Embryonicstemcells,EScells)和胚胎生殖细胞(Embryonicgermcells,EGcells),这些细胞具有自我更新能力和高度增殖以及多向分化潜能,并可以定向诱导分化为该生物体所有种类的细胞,甚至形成复杂的组织和器官。人ES和EG细胞对于人类胚胎发育、疾病研究、器官移植、基因治疗以及新药的研制筛选等方面提供了一条新思路。胚胎原生殖细胞(primordialgermcells,PGC)是国外用作分离和克隆干细胞的一种新细胞资源,直到近年来,其本来面目才逐渐被揭示开来。本研究从5-9w人胚胎生殖嵴中消化分离原生殖细胞(PGC),并对PGC的体外培养和分化进行了研究,为进一步PGC的诱导分化等研究提供实验材料。1．小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)和人胚胎成纤维细胞(HEF)的分离培养饲养层细胞能够分泌LIF、SCF和bFGF,对于培养中PGC的存活和增殖是必需的,不仅可以使其数量增加,而且与PGC在体内和体外的分化有关。本实验以妊娠13-14d昆明小鼠和临床人工终止妊娠的废弃胎儿(5-9w)为材料,建立了PMEF和HEF分离培养体系：采用0.25％胰蛋白酶 0.04％EDTA作用3-5min得到理想的PMEF和HEF;并采用差速贴壁分离法纯化PMEF和HEF;PMEF和HEF对PGC的培养结果显示无显著差异。2．大鼠心肌细胞的分离和培养国外许多实验室采用大鼠肝细胞(BRL)等制作条件培养基(CM)来维审囚军区大学项士学位论文持ES细胞。这些CM中都含有相当高含量的＊和SCF等因于,这些因子可以有效地抑制干细胞的分化。国内也有采用大鼠心肌条件培养基（N－CM）成功建立和维持小鼠ES细胞系的报道。本实验大鼠心肌细胞取自于新生Zd的SD大鼠：采用低浓度胰蛋白酶分段消化收集的方法,可有效减少消化对于心肌细胞的损害;并采用差速贴壁分离法纯化心肌细胞,可获得纯度大于90％的心肌细胞。心肌细胞在培养10h后贴壁,个别细胞有搏动,24h后约60％的细胞在搏动。培养的心肌细胞一般可存活10d以上。结果显示：培养3．6d的心肌细胞搏动频率最稳定,细胞形态保持最好,故而选取该时问收集培养液,制作条件培养基。3．人胚胎原生殖细胞的分离和培养我们选用5－gW（受精龄）临床人工终止好娠的废弃胎儿29个,将其生殖峭组织消化后接种在饲养层上,使用RH（M培养得到第四代PGC2株。AP染色呈阳性。体外分化实验（致裸鼠成瘤实验）显示此细胞具有发育多能性。在分离过程中,其在饲养层上有三种克隆形式：较大的克隆包括没有散刀‘的生殖峭体细胞和P＊C,更易增殖,且不易分化：单个或由于迁移运动而聚集＊＊C介始以单层方式增殖,可形成多层细胞的克隆,前者克隆较小,后者克隆较大,单个PGC和较小的克隆容易分化。离散生4自峭和增殖PGC克隆时机和方法是影响建系的关键因素。本研究发现：＊＊C在丁爿容易发生白然分化,故…Z在培养5－“时进行＊＊C克隆的离散;俏化时问过K则细胞死亡率增加,单个＊GC＠广数量增加,且消化组织块时还可导致杂细胞增多,囚此,当PGC集落消化为若干细胞个细胞团时,就应中止消化,不要分散为单个细胞。PGC在无饲养层、’（k养层不良、延长培养和悬浮培养时能够自然分化。分化出内胚层样细胞、神经细胞、成纤维细）地、上皮样细胞、l（IL内皮细胞和胚体（EB）。我们把PGC细胞注入裸鼠体内,29d后得到畸胎瘤。证实了此细胞在体内的发育多能性。