论文部分内容阅读
研究背景:全反式维甲酸通过诱导体内APL细胞分化,使几乎所有急性早幼粒细胞白血病(APL)患者获得完全缓解。然而,长期ATRA治疗可引起多药耐药。为能够充分了解ATRA引起肿瘤细胞多药耐药的作用机制,我课题组前期研究使用ATRA筛选出了具有多药耐药性的HL-60/ATRA耐药细胞株。通过抑制消减杂交获得了耐药相关新序列——HA117,并在NCBI数据库登录,获得登录号登录号:CB214920。通过生物信息学分析我们发现HA117定位于14q24.2反义链,其邻近区域内还分布着RGS6、FOXA1、NFKBIA、BMP4、BCL11B、AKT1等调控细胞分化,影响肿瘤发生、发展的基因。方法:(1)应用生物信息学手段对HA117进行了定性分析;(2)应用Lnc Tar软件预测到HA117与RGS6的相互作用关系及作用位点;(3)对HA117过表达复发/耐药组和HA117低表达完全缓解组患儿骨髓细胞表达谱芯片分析,探讨HA117在肿瘤耐药发生中可能的机制;(4)以野生型HL60细胞、耐药株HL60/ATRA细胞、敲减HA117的HL60/ATRA细胞sh RNA转染株和HA117过表达病毒转染的HL60细胞为模型,检测各细胞株中m RNA水平RGS6各功能区的表达情况,总蛋白、核蛋白、胞浆蛋白水平RGS6的表达情况,免疫荧光分析RGS6的细胞定位情况,检测各细胞株种DNMT1在m RNA水平和蛋白水平的表达情况,免疫荧光分析了各细胞株的甲基化水平,分析肿瘤干细胞标志物、干细胞标志物在m RNA和蛋白水平表达情况;(5)本次研究重复了HL60/ATRA耐药细胞株建立过程,检测了细胞株建立过程中,每5代细胞的增殖、迁移能力、化疗药物敏感性及肿瘤干细胞/干细胞标志物的表达情况。结果:(1)通过ORF框分析和编码能力评分,发现HA117是一条长链非编码RNA(lnc RNA);(2)HA117与RGS6间存在相互作用,作用位点为RGS6 m RNA序列的1-301bp和769-1108bp区域;(3)芯片分析结果显示,HA117可通过促进细胞增殖、存活,抑制细胞分化、凋亡从而引起细胞耐药的形成;(4)细胞实验结果显示,当HA117高表达时,RGS6 GGL功能区表达降低,RGS6蛋白呈现核内聚集,蛋白水平细胞内DNMT1表达升高,细胞甲基化水平升高,肿瘤干细胞标志物、干细胞标志物在m RNA和蛋白水平表达升高;(5)重复HL60/ATRA耐药株建立过程,对各代次细胞表型及基因表达检测结果显示,随着ATRA刺激代次增加,细胞的增殖、迁移能力,DNMT1及肿瘤干细胞/干细胞标志物的表达呈波浪形上升,在35代后开始稳步上升且与HA117的表达正相关,而化疗药物敏感性与HA117的表达负相关。结论:首次揭示了HA117可调节RGS6可变剪切下调GGL区的表达,从而抑制DNMT1的降解,引起了HL60肿瘤细胞干性增强,因此我们推测,HA117的表达调控了细胞干性的形成与维持,进而引起肿瘤细胞的多药耐药。研究背景:先天性肠无神经节细胞症(Hischsprung’s Disease,HSCR)是最常见的肠道先天性畸形,受多种信号途径调控。这些信号通路中的许多重要分子节点都是micro RNA(miRNA)的作用靶点。目前的已有关于miRNA与HSCR疾病的相关性研究,也有研究发现HSCR患者的血清miRNA与正常人血清miRNA存在差异表达,但HSCR结肠组织中的miRNA全表达谱情况尚未有研究。方法:(1)使用Exiqon miRCURY LNA?芯片对正常结肠和HSCR病变段痉挛结肠进行了miRNA表达谱芯片分析,通过数据标准化和火山图过滤后,我们筛选出差异表达的的miRNA(104个上调和64个下调);(2)使用miRWalk的Validated target功能获得差异表达miRNA已有实验验证的靶基因;(3)使用NCBI pubmed和Go Gene文献检索引擎检索文献中报道的与HSCR发生密切相关的m RNA并与(2)中筛选获得的miRNA靶基因进行联合分析;(4)对筛选出的与HSCR发生相关的miRNA靶基因进行PATHWAY分析;(5)对筛选出的miRNA及其靶基因在组织标本中进行表达验证。结果:(1)miRNA芯片对正常结肠和HSCR病变段痉挛结肠进行了miRNA表达谱分析,通过数据标准化和火山图过滤后,我们筛选出了168个差异表达的miRNA(104个上调和64个下调);(2)miRWalk对miRNA已有实验验证的靶基因预测结果和NCBI pubmed和Go Gene文献检索引擎检索文献中报道的与HSCR发生密切相关的m RNA结果联合分析,我们共筛选出50个与HSCR发生相关的miRNA靶基因;(3)PATHWAY结果显示50个靶基因中的7个靶基因富集在RET及其相关信号通路(MAPK3/PI3K/AKT),这7个靶基因对应7个差异表达的miRNA;(4)在组织标本中验证这7个差异表达的miRNA的表达发现,hsa-miR-142-3p,hsa-miR-146b-5p,hsa-miR-429,hsa-miR-938-3p,hsa-miR-369-3p的表达与芯片结果一致,其靶基因表达与miRNA表达负相关。结论:hsa-miR-142-3p,hsa-miR-146b-5p,hsa-miR-429,hsa-miR-938-3p,hsa-miR-369-3p的差异表达,可能通过调控RET及其相关信号通路参与了HSCR的发生。