【摘 要】
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目的:肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤,病情进展快,恶性程度高,预后差,其死亡率占我国恶性肿瘤的第二位。在临床上肝细胞癌发现时常常是中晚期,治疗方案极其有限。因此,研究肝细胞癌的发生发展机制,发现更多的治疗靶点非常重要。促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白（CRHBP）可以调节多种生理反应。TCGA数据库显示CRHBP在肝细胞癌组织中表达量明显下调,提示CRHBP可能在肝细胞癌的发展中起着一定作用。本研究
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目的:肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤,病情进展快,恶性程度高,预后差,其死亡率占我国恶性肿瘤的第二位。在临床上肝细胞癌发现时常常是中晚期,治疗方案极其有限。因此,研究肝细胞癌的发生发展机制,发现更多的治疗靶点非常重要。促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白（CRHBP）可以调节多种生理反应。TCGA数据库显示CRHBP在肝细胞癌组织中表达量明显下调,提示CRHBP可能在肝细胞癌的发展中起着一定作用。本研究旨在探索CRHBP对肝细胞癌细胞功能学的影响,进一步为肝细胞癌的治疗提出更多的理论依据。方法:本研究主要包含三个部分。1.第一部分通过免疫组化检测CRHBP在肝细胞癌组织和正常肝组织的蛋白表达水平。2.第二部分关于CRHBP对肝细胞癌细胞功能学的影响。（1）运用质粒在LM3细胞中过表达CRHBP,然后再通过96孔板使用倍比稀释法挑选单克隆的稳转株,高转染效率的单克隆稳转株通过qPCR和Western-Blot筛选。（2）检测LM3细胞过表达CRHBP后的生物学行为变化:CCK8增殖实验进一步检测细胞增殖;细胞划痕实验、Transwell实验:可以检测细胞迁移及侵袭。3.第三部分关于CRHBP抑制肝细胞癌转移的分子机制研究。运用Western-Blot术检测LM3细胞过表达CRHBP后,检测上皮间质转化（EMT）相关基因（ZO-1、E-cadherin、N-cadherin、Snail）,研究CRHBP对EMT通路相关基因的调控作用。结果:1.第一部分:免疫组织化学技术检测的结果显示CRHBP在人肝细胞癌组织中的表达显著低于正常肝组织（P<0.01）。2.第二部分:（1）在过表达CRHBP的LM3细胞中,通过q RT-PCR及Western-Blot方法,进一步筛转染效率高的单克隆的稳转株（P<0.05）。（2）LM3细胞过表达CRHBP后,再从中筛选出单克隆稳转株,后进行各项细胞功能学实验。CCK-8结果显示CRHBP过表达抑制了LM3细胞增殖（P<0.05）,细胞划痕实验结果过表达CRHBP后明显抑制了LM3细胞的迁移（P<0.0001）,Transwell实验结果过表达CRHBP后明显抑制了LM3细胞的迁移和侵袭（P<0.0001）。3.第三部分:在LM3细胞中,过表达CRHBP抑制了Snail、N-cadherin,促进了E-cadherin和ZO-1等相关EMT指标的表达（P<0.05）。结论:CRHBP可以抑制肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制肝细胞癌细胞上皮间质转化。CRHBP在肝细胞癌组织中的表达可能是一个肝细胞癌临床预后预测指标和潜在的治疗靶点。
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