microRNA及circRNA介导的水稻H4抗稻瘟病的分子机制研究

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jyk1987525
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近年来,得益于高通量测序技术的蓬勃的发展,针对一些nc RNA的研究已从鉴定发现阶段深入到功能研究甚至是由点及面的调控网络等中高级阶段,并取得突破性的进展。大量研究表明,micro RNA(mi RNA)在生物发育的过程中,有着不亚于蛋白质的重要作用,其参与植物的细胞生长、组织分化、激素调节以及逆境胁迫响应等各个方面。除此之外,在水稻中也鉴定得到许多受稻瘟菌诱导的mi RNA,但对于它们参与免疫应答的具体机制还不清楚。最近报道指出环状RNA(circ RNA)可以作为“海绵”竞争性的结合mi RNA,进而阻止mi RNA对靶基因m RNA的切割。mi RNA的功能及其参与的调控网络是否受到circ RNA的调控或影响、内源的nc RNA是怎样通过调控基因表达,介导植物应对逆境胁迫等问题有待我们去深入挖掘与阐明。本研究以稳定、高抗稻瘟病水稻品系H4及感病品种中二软占为材料,对前期Small RNA测序得到的响应稻瘟病菌侵染的mi RNA进行进一步的统计分析,并利用降解组测序对其可能的靶基因进行鉴定,同时也鉴定了响应稻瘟病菌侵染的circ RNA;进一步结合生物信息学、生物化学与分子生物学等手段对mi RNA T46及其靶基因进行了功能初步验证,并综合分析了mi RNA、circ RNA及其相应靶基因之间的内在联系。取得以下重要研究结果:(1)利用降解组测序技术对前期H4和中二软占文库中鉴定得到的响应稻瘟病侵染的known mi RNA和novel mi RNA靶基因分别进行了分析,鉴定得到236个known mi RNA的1175个靶基因和23个novel mi RNA的176个靶基因。Known mi RNA GO及KEGG注释显示,靶基因主要富集在转录活性调控、激素的信号传导网络等方面。Novel mi RNA GO及KEGG注释功能注释显示,靶基因主要富集在酶的活性调节、植物-病原菌互作、氧化磷酸化及过氧化物反应等过程中。(2)mi RNA的Northern blot结果表明,除mi RNA T42只在H4中被检测到外,其余11个mi RNA都能在抗、感材料中表达。对接种稻瘟病菌前后mi RNA茎环PCR定量分析结果显示:挑选的3个known mi RNA都与其靶基因的表达量呈负相关;9个novel mi RNA在抗、感材料中表现出相似的表达模式,8个novel mi RNA在抗、感材料中表现出不同的表达模式。结合靶基因定量分析结果表明,有7个novel mi RNA在抗、感材料中的表达均与其靶基因负相关,4个novel mi RNA在单一品系中与其靶基因负相关;而其它3个novel mi RNA(T13、T31和T37)在抗、感材料中与其靶基因都无明显的相关性。(3)Circ RNA测序共预测得到2900个circ RNA。差异表达分析显示,接种前后抗病样本中,R_Mock vs R_12hpi,R_Mock vs R_24hpi和R_12hpi vs R_24hpi分别有14个、9个和12个circ RNAs的表达量存在显著差异。同样的,在感病样本中,S_Mock vs S_12hpi,S_Mock vs S_24hpi和S_12hpi vs R_24hpi分别有10个、12个和10个circ RNAs的表达量存在显著差异。其差异表达模式大致可分为两类,一类为品种特异型,如circ2465、circ2466、circ192和circ2595等。另一类为病原菌诱导型,如接种后,抗病样本中的circ72、circ519和circ1577等表达量均上升,感病样本中的circ236、circ448和circ1278等均下调表达。进一步对circ RNA与mi RNA结合位点预测的结果表明,共找到5个mi RNA(T6、T34、T41、T42和T43)的14个circ RNA结合位点,且circ RNA与mi RNA的互补配对都存在一定错配。(4)结合前期预测与降解组测序的结果,得到novel mi RNA T46的2个靶基因,主效抗稻瘟病基因Pik2-H4和NADPH氧化还原酶,它们都受稻瘟病菌诱导,且与T46的表达量呈负相关。半定量及定量结果显示T46在根、茎及叶中都有表达。对位于Pik位点上的等位基因3’UTR序列进行比对分析,结果表明这些Pik等位基因3’UTR区域无碱基差异,推测它们都受T46的剪切;T46转基因植株抗病性鉴定表明,过表达T46会导致水稻感病,推测过表达植株中T46的表达量增加,持续对抗病基因Pik2-H4进行剪切,致使R蛋白降解,植株感病;而敲除或靶模拟捕获T46的转基因植株均表现为抗病。T46敲除植株或靶模拟植株均能抑制T46对靶基因的剪切作用,从而使抗病基因Pik2-H4得以持续表达,赋予植株抗性;T46接种瘟病菌GD0193(Avr Pik H4)及GD0193m(ΔAvr Pik H4)后,表达趋势未出现明显不同,在抗、感水品种中都受稻瘟病菌诱导而表现先下降后升高的趋势,表明T46与Avr Pik H4没有直接关系。
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