目的以体外原代培养人脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells, ASCs)为研究对象,观察不同重力矢量条件,以及血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor, PDGF)影响下,ASCs在PLGA电纺膜表面的黏附定植情况。探讨重力因素和趋化因子对干细胞在组织工程支架上的黏附定植和增殖功能活动的影响及其二者之间的相互作用。材料和方法1、PLGA电纺膜制备以24ml三氯甲烷(Trichloromethane, TCM,分析纯)和6ml N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide, DMF,分析纯)按体积比8:2混合,将5.4g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid, PLGA,固有粘度0.76dl/g,重均分子量80,000Da)与之溶解混合成18%质量体积比电纺溶液。在推射速率1ml/h、场电压14KV、喷射距离12cm条件下,静电纺丝法制备PLGA电纺膜。成品厚度约为600μm,最大可利用面积约26.0×19.0cm2,密度约为0.172g/cm3,质量为5.4g。PLGA电纺膜裁剪为直径4.5min圆形试件后密封,钻-60辐射消毒24h(累积放射剂量25K Gy)后保存待用。2、ASCs提取无菌条件下提取新鲜的面部轮廓整形手术所切取的人颊脂垫脂肪组织10ml,剪碎为1mm3体积的颗粒,以Ⅰ型胶原酶消化,离心法获得ASCs,加入完全DMEM培养基,在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度条件下原代培养至第14天时,对培养皿底部贴壁细胞以0.25%胰蛋白酶消化,计数,每3天换液,达到80%融合时传代。ASCs传至第5代(Passage Five, P5)时,-80℃冰箱冷冻保存。3、实验分组常规复苏课题组前期冻存的P5ASCs。复苏后每3天换液,达到80%融合时传代。取生长良好的P6ASCs,0.25%胰蛋白酶消化,在DMEM培养液内调整细胞计数至3×104/ml。将该ASCs细胞悬液按100μl/孔(细胞数量3000)依次加入96孔板。依照实验设计分为四组,每组3孑L：(1)PDGF/重力矢量(+)组：用微量加样枪滴加1μl含0.01ng PDGF的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline, PBS)至PLGA电纺膜上,置于培养孔底,细胞悬液铺于PLGA电纺膜之上；(2)PBS／重力矢量(+)组：滴加1μl空白PBS至PLGA电纺膜上,置于培养孔底,细胞悬液铺于PLGA电纺膜上；(3)PDGF/重力矢量(-)组：用微量加样枪滴加1μl含0.01ngPDGF的PBS至PLGA电纺膜上,将膜覆盖于培养孔细胞悬液上方；(4)PBS/重力矢量(一)组：用微量加样枪滴加1μl空白PBS至PLGA电纺膜上,将膜覆盖于培养孔细胞悬液上方。4、检测分析将96孔板置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度条件下培养,分别于第0,1,3,5,8,11天同一时间点,每组取3孔,加入10μl Alamar Blue试剂,继续孵化。24h后在570nm和600nm波长条件下测定细胞悬液内的OD值,参照标准曲线计算各组PLGA电纺膜上定植ASCs的相对数量及其增殖功能活动情况。分析PDGF趋化吸引对于ASCs在PLGA电纺膜上黏附的趋化作用,以及重力因素与该趋化作用之间的相互影响。进一步探讨对于具有一定体积和三维空间结构的组织工程支架,上述因素可能产生的影响作用。实验检测数据导入SPSS20.0软件,进行重复测量的三因素一元方差分析,以P<0.05为有显著性差异。结果1、针对重力矢量方向的影响作用,在添加PDGF的实验组,重力矢量(+)组在第1、2、4、6、9、12天的Alamar Blue下降百分数均显著高于同一时间点重力矢量(-)组。显示重力矢量方向对细胞在支架材料表面的黏附及进一步的增殖活动产生明显的影响,并且贯穿实验始终。而在添加空白PBS的对照组,也呈现类似的结果。说明有利的重力矢量方向是对ASCs的黏附定植和增殖产生决定性影响的因素。2、针对PDGF勺趋化诱导作用,在重力矢量(+)条件下,添加PDGF实验组的Alamar Blue在第1、2、4天的下降百分数与同一时间点添加PBS对照组无明显差别,但第6、9、12天的下降百分数明显高于同一时间点添加PBS的对照组。提示在重力矢量有利的环境中,趋化吸引并不对ASCs早期的黏附和定植具有明显影响；一旦ASCs进入快速增殖期,趋化因子可具有显著促进作用。在重力矢量(-)条件下,添加PDGF实验组第1、2、4、6、9、12天的下降百分数叫显高于同一时间点添加PBS的对照组。说明在重力矢量方向不利的环境中,趋化诱导效应能部分抵消不利影响,促进ASCs黏附定植与增殖。3、相对ASCs在PLGA电纺膜上增殖活动的时问-空间变化趋势而言,随实验时间间期延长,可见各组ASCs增殖活动明显提高,且各时间点之间具有显著性差异；结果提示,ASCs在支架上黏附定植后,均有明显的增殖活动。在同一时间点(第6,9,12天)横向对比,各组ASCs的增殖活动水平亦具有显著性差异；提示重力矢量方向和PDGF趋化吸引作用,均对细胞在组织工程支架上的黏附与增殖具有明显影响,二者具有交互效应,并随时间延长对ASCs的增殖叠加影响,各实验组间产生显著性差异。在本实验中,随实验间期延长,采取有利的重力矢量方向以及PDGF趋化诱导组的ASCs在支架上的黏附定植和增殖呈现出相对于其他各组明显的优势。结论1、静电纺丝制备的PLGA电纺膜,孔隙率高,纤维交织构成疏松多孔结构,近似细胞间质的支架作用,有利于ASCs种子细胞黏附定植及增殖。2、细胞因子PDGF具有明显诱导ASCs趋化聚集作用,能显著改善ASCs在PLGA电纺膜支架上的黏附与增殖。3、重力矢量因素对于ASCs在PLGA电纺膜上的黏附定植与增殖功能活动具有显著影响,有利的重力矢量方向是对ASCs的黏附定植和增殖产生决定性影响的因素。4、重力矢量方向和PDGF趋化吸引作用,均对种子细胞在组织工程支架上的黏附与增殖具有明显影响,二者具有交互效应,并随时间延长对ASCs的增殖叠加影响。5、应用趋化因子诱导能在早期有效地促进种子细胞在支架材料的黏附与聚集,并可明显克服不利重力矢量因素影响,提高组织工程效能。