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赖氨酸氨肽酶（Lysine aminopeptidase,LAP）是一类能够水解多肽N末端附近肽键的外切蛋白酶,对于切割赖氨酸残基释放出游离赖氨酸的效率最高。它能够作为一种风味蛋白酶,去除蛋白水解液中形成的苦味肽提高产品的适口性,还可以广泛应用于饲料加工、医疗诊断、蛋白测序、美容护肤等行业,具有很高的研究意义和应用价值。耐热酶在高温条件下能够维持一定的活性,应用于工业生产能够降低成本、简化工艺、提高生产率,前景十分广阔。本文以铜绿假单胞菌NJ-814（Pseudomonas aeruginosa NJ-814）基因组DNA为模板,设计特异性引物克隆出赖氨酸氨肽酶编码基因lap,构建重组质粒pET42a-lap热激转化到原核表达宿主E.coli BL21中形成重组菌BLAP,并成功实现了重组赖氨酸氨肽酶的表达。BLAP在发酵初始培养基中16℃,220 r·min-1诱导72 h后胞内酶活达到稳定值2.54 U·m L-1。通过构建分子伴侣、添加表面活性剂、添加渗透剂等措施寻求重组蛋白的胞外分泌策略,研究发现向发酵液中添加浓度为1%的山梨醇能够促进约0.29 U·mL-1的胞内重组酶分泌到胞外。利用镍柱亲和层析（Ni-NTA）进行分离纯化得到电泳纯的重组酶酶液,纯化倍数4.7,回收率83.5%。对纯化后重组酶酶学性质研究发现,在pH 8.5左右重组酶具有最高的催化活力,最适反应温度为80℃,其pH稳定区间为6.010.0,经过70℃热处理1 h仍能保留60%以上的酶活性。金属离子Ni2+、Zn2+和蛋白抑制剂DDT、β-巯基乙醇、EDTA对重组赖氨酸氨肽酶酶活具有明显的抑制作用,Mn2+、Ca2+、Cu2+和PMSF对酶活影响有限,而Mg2+和Co2+能够促进重组酶的活性,Co2+能将重组酶酶活提高为原来的4倍。该重组酶能够水解Arg-pNA、Leu-pNA和Lys-pNA三种底物,但对Lys-pNA水解能力最强,酶动力学分析显示以Lys-pNA为底物时的米氏常数Km值为4.86 mmol·L-1、最大反应速率Vmax值为8.76μmol·L-1·min-1。摇瓶阶段优化后最利于重组酶表达的培养基为:0.5%葡萄糖,2%鱼粉蛋白胨,3%酵母浸膏,55 mmol·L-1 K2HPO4,17 mmol·L-1 KH2PO4,0.4 mmol·L-1 CoCl2,初始pH 7.5,装液量40 m L/250 m L。以2%的接种量于37℃,220 r·min-1摇床中培养8 h后向发酵液中加入终浓度0.5 mmol·L-1的诱导剂IPTG,转到16℃,240 r·min-1摇床中诱导重组赖氨酸氨肽酶表达。经过优化后最高酶活达到3.47 U·m L-1,为优化前的1.37倍。利用全质粒PCR技术对赖氨酸氨肽酶编码基因的特定位点进行定向突变,通过删除位于非活性中心的PA结构域,获取热稳定性提高了约10%的突变赖氨酸氨肽酶,为揭示耐热蛋白酶的结构和功能建立了一定的关系。初步考察了突变酶与碱性蛋白酶复配水解大米蛋白的应用,结果显示该酶能够有效作用于分子量2000 Da以上的多肽,复配水解后水解液中180 Da以下的游离氨基酸等小分子物质比未处理原料的提高了97倍。