论文部分内容阅读
目的:通过N乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ(N-acetylglucosaminyltransferase V,Mgat5)慢病毒载体上调大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后局部组织中N糖链β-1,6-乙酰氨基葡萄糖分支表达水平,观察其对损伤脊髓的保护作用,并探讨发挥SCI保护作用的可能机制。方法:(1)构建大鼠Mgat5慢病毒载体并测定病毒滴度。(2)大鼠原代背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)细胞提取及纯度鉴定。(3)不同感染复数(Multiplicity of infection,MOI)处理DRG细胞24 h、48 h、72 h后,倒置荧光显微镜观察转染效率,确定最佳转染MOI值。(4)用最佳MOI值转染DRG细胞1、3、5、7 d后,CCK8法检测Mgat5慢病毒载体对神经元细胞的毒性。(5)最佳MOI值转染DRG细胞7 d后,PHA-L结合实验检测DRG细胞中N糖链β-1,6-乙酰氨基葡萄糖分支表达水平。(6)取3只雌性SD大鼠(200-220g),血管夹钳夹法构建脊髓损伤动物模型,使用微量注射器在脊髓两个不同位点(距损伤中心1.5 mm)分别注射11μL阴性对照慢病毒,注射深度约为1 mm,于第3 d、7 d、14 d取脊髓组织制作冰冻切片,荧光显微镜下观察慢病毒体内感染效果。另取120只大鼠随机均分成5组:单纯损伤模型组(椎板切除+SCI,简称SCI组);实验组(椎板切除+SCI+Lv-Mgat5,简称Lv-Mgat5组);空载慢病毒组(椎板切除+SCI+Lv,简称Lv组);甲强龙组(椎板切除+SCI+甲强龙,简称MP组);假手术组(仅椎板切除,简称Sham)。造模成功后,分别于第3 d、7 d、14 d行BBB评分和斜板功能评分检测运动功能,观察大鼠神经功能变化后,取损伤段脊髓组织,利用PHA-L结合实验检测各组N糖链β-1,6-乙酰氨基葡萄糖分支表达水平;利用western-blot法检测各组Mgat5、GAP-43表达变化;酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组炎症因子IL-1β、IL-10、TNFα的表达变化。结果:(1)成功构建表达Mgat5的慢病毒载体。(2)成功培养成年大鼠原代DRG细胞,经鉴定纯度为90%。(3)Mgat5慢病毒载体成功感染大鼠DRG细胞,确定MOI=10为最佳转染剂量。(4)CCK8结果显示,MOI=10转染细胞1、3、5、7 d后,Mgat5慢病毒对神经元细胞活性均无显著影响。(5)PHA-L结合实验证明慢病毒载体介导的Mgat5能够显著提高DRG细胞表面N糖链β-1,6-乙酰氨基葡萄糖分支水平。(6)大鼠脊髓组织在转染慢病毒后各时间点均有较强的荧光表达,表明慢病毒可以在脊髓损伤区域组织中持续稳定表达。(7)BBB评分结果显示,SCI后大鼠后肢处于完全瘫痪状态,BBB评分均稳定在0分,说明动物模型建造成功,损伤一致。BBB评分与斜板实验结果证明,与SCI only组的评分比较,MP组与Lv-Mgat5组显著提高,Lv组与SCI模型组相比无显著差异;(8)脊髓组织PHA-L结合实验结果显示,与SCI组比较,Lv-Mgat5组N糖链β-1,6-乙酰氨基葡萄糖分支水平在第3 d、7 d、14 d均显著升高,MP组仅于第3 d表达增加,其余组各时间点N糖链β-1,6-乙酰氨基葡萄糖分支的水平均无显著差异。(9)Western blot结果显示,与SCI组比较,Lv-Mgat5组在术后第3 d、7 d、14 d Mgat5蛋白表达量均显著升高,MP组Mgat5蛋白表达量仅于伤后第3 d显著升高,而其他组相较于SCI组,Mgat5蛋白在各时间表达量均无显著差异。而GAP-43蛋白在损伤第3 d,与SCI组比较,各组均无显著变化;在损伤第7 d、14 d,Lv-Mgat5组GAP-43蛋白表达量相较于SCI组均显著升高;MP组GAP-43蛋白表达量仅于损伤后第7 d表达升高。(10)ELISA结果表明,MP组和Lv-Mgat5组IL-1β、TNFα表达水平在各时间点均显著降低,与SCI组比较,具有显著统计学差异;MP组IL-10表达水平在3个时间节点均明显升高,而在Lv-Mgat5组中,IL-10表达水平于损伤后第7 d开始出现升高,并持续到14 d,两组与SCI组比较,均具有显著统计学差异。结论:本研究成功构建了Mgat5慢病毒载体,该病毒载体能够在体内外稳定感染,对细胞生长无明显影响,感染慢病毒后能够提高细胞及脊髓组织中N糖链β-1,6-乙酰氨基葡萄糖分支表达水平。通过局部注射Mgat5慢病毒载体,可在一定程度上促进损伤脊髓神经轴突再生,加快大鼠后肢运动功能的恢复。本研究证明,慢病毒载体介导的Mgat5可能成为SCI治疗的有效手段之一,其可能的作用机制为:重组慢病毒载体能够稳定地在脊髓神经组织中表达Mgat5,进而增加组织中N糖链β-1,6-乙酰氨基葡萄糖分支水平,通过下调促炎细胞因子TNF-α,IL-1-β,上调抑炎因子IL-10的表达,减少损伤脊髓中的炎症反应,并促进损伤脊髓组织中GAP-43表达,最终促进脊髓损伤区神经轴突的再生。