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同种蛋白酶作用于混合蛋白体系中的各种蛋白质组分,产生的酶解效果并不相同,从而体现出该酶对各组分的选择性酶解作用。本研究通过分析和对比6种商业蛋白酶对牛乳蛋白组分的不同酶解效果,期望得出各种酶对乳蛋白组分的选择性酶解顺序的基础数据,并基于此探索出在尽可能短的时间内,较好地保持部分蛋白质分子的完整性,同时最大限度地降低牛乳致敏性的酶解工艺。主要研究结果如下:
1.建立了适宜分析蛋白酶制剂对乳蛋白体系以及其他混合蛋白体系中各蛋白质组分选择性酶解的有效实验方法。
2.得出了牛乳常乳乳清中5种主要蛋白,牛初乳乳清中4种主要蛋白在6种商业蛋白酶(复合蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶)单独作用下的选择性酶解次序,以及牛乳中2种主要酪蛋白在5种蛋白酶(复合蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶)单独作用下的选择性酶解次序。并以此筛选出复合蛋白酶(Protamex)与风味蛋白酶(Flavourzyme)两种酶制剂作为酶解法降低婴儿奶粉致敏性研究部分的实验用酶。
3.用响应面法优化两种酶制剂分段降解法降低婴儿奶粉致敏性工艺,综合考虑蛋白质水解度以及总的酶解反应时间,得出2种适宜的工艺条件:其一,反应温度50℃、pH7.0、底物浓度5g/100mL、E/S总为600U/g、酶解总时间82min、复合蛋白酶(Protamex)与风味蛋白酶(Flavourzyme)两种酶制剂均在反应开始时加入、Protamex与Flavourzyme的复配比例为0.96;其二,反应温度50℃、pH7.0、底物浓度5g/100mL、E/S总为600U/g、酶解总时间84min、两种酶制剂均在反应开始时加入、Protamex与Flavourzyme的复配比例为0.86。分别得到样品蛋白质水解度为7.090%与7.121%。
4.非还原性SDS-PAGE不连续垂直电泳分析表明:在Protamex与Flavourzyme的共同作用下各酶解样品的蛋白质组分水解顺序都相同,即相对优先降解酪蛋白组分和小分子乳清蛋白组分。说明在特定蛋白酶作用下,酶解工艺参数主要影响蛋白质底物的水解度。
5.ELISA测定结果表明:经Protamex与Flavourzyme降解后的各酶解产物其β-Lg及Casein的抗原性均明显降低,而且在本研究的酶解模式下各酶解样品的抗原性降低程度与其水解度体现出良好的正相关性。