论文部分内容阅读
乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一类能够发酵碳水化合物并产生乳酸的革兰氏染色阳性细菌的统称。乳酸菌具有诸多益生功能,如:提高机体抗氧化能力延缓衰老,增加肠内有益菌减少有害菌,治疗传染性疾病和消化道疾病,刺激机体的免疫机能,降胆固醇降血压等。现已发现的乳酸菌有近30个属,包括双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、片球菌属(Pediococcus)、罗氏菌属(Rothia)、明串菌属(Leuconoostoc)等。乳杆菌属、乳球菌属等乳酸菌因能够在胃肠道、泌尿、生殖系统中或粘膜部位粘附存活且无病原性等特点而尤其受到人们的重视。近十几年来,运用基因工程技术,构建乳酸杆菌表达系统表达外源蛋白以及作为新型疫苗载体等方面已引起了广泛关注,但由于乳酸杆菌属于革兰氏阳性菌,细胞壁厚而致密,不仅其内源蛋白、表达的非分泌性外源蛋白、核酸以及其他非分泌性代谢产物的提取效率极低,而且外源DNA的转化效率也极低,这严重制约了乳酸杆菌分子机制的研究和基因工程技术的发展,且要实现外源基因在乳酸杆菌中异源表达,首先要实现乳酸杆菌的高效转化。因此,乳酸杆菌分子机制研究和基因工程发展的过程中迫切需要解决的关键问题是探索一种有效的乳酸菌破壁方法及提高其转化效率。主要研究内容分为以下2个部分:1.乳酸杆菌破壁方法的探究试验通过反复冻融破壁法、溶菌酶破壁法、氧化锆珠破壁法、超声波破壁法对植物乳杆菌Lactobacillus.plantarum1.557进行破壁处理,并以革兰氏染色和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)为评价方法,比较破壁效果和破壁时间的差异。此外,通过β-葡萄糖醛酸酶(GUS)活力的测定对氧化锆珠破壁法所提蛋白进行活性检测,通过琼脂糖凝胶电泳对氧化锆珠破壁法所提RNA的质量进行了检测。结果表明:氧化锆珠破壁法优胜于其他几种处理方法,该法所提取的GUS蛋白具有蛋白活性,该法所提取的RNA的OD260/OD280的比值在1.8～2.1之间,符合标准的比值,纯度较高,降解程度低。因此,氧化锆珠破壁法适用于快速提取乳酸杆菌菌体蛋白和总RNA。然后,试验在菌体重量、研磨buffer和研磨时间这3方面对氧化锆珠破壁法进行了优化,并通过SDS-PAGE来分析其破壁效果。在优化后条件下,同时对6株乳酸菌进行破壁处理并通过SDS-PAGE来分析其破壁效果。结果表明:在菌体重量、研磨buffer、锆珠三者的加入比例(W/V/W)为0.013 g:300uL:1g的条件下,研磨15min,提取的蛋白图谱条带清晰,丰度高;RIPA、PBS、PENP、GUS作为研磨buffer时,提取的蛋白图谱条带清晰且丰度高,而8M尿素作为研磨buffer时,图谱条带模糊且丰度低;6株乳酸菌经该方法破壁处理后,蛋白图谱条带均具有较高的丰度和清晰度。因此,对于乳酸菌的破壁,氧化锆珠破壁法具有快速、高效、经济的优点。本试验所探究的成功提取乳酸菌蛋白的方法也为下一步研究乳酸杆菌限制-修饰系统对转化效率的影响(电转化经乳酸菌胞浆蛋白体外修饰的质粒DNA)奠定了平台基础。2.乳酸杆菌限制-修饰系统对转化效率影响的探究本研究利用电转化方法探究了乳酸杆菌限制-修饰系统对电转化效率的影响,以期提高乳酸杆菌的电转化效率。试验通过测定5株乳酸杆菌—植物乳杆菌(L.plantarum1.557)、植物乳杆菌(L.plantarum WCFS1)、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌的生长曲线,来确定这5株菌的对数生长期,然后选择处于对数生长期的5株菌分别转接到含不同浓度甘氨酸的培养基中培养并通过测定生长曲线,来探索细胞壁弱化剂(甘氨酸)的适宜浓度及加入时间,在此基础上,制备5株乳酸杆菌的感受态细胞。同时,通过观察5株乳酸杆菌在含不同浓度红霉素的培养基中的生长情况来确定电转化后用于筛选转化子的红霉素浓度。研究结果表明:植物乳杆菌(L.plantarum1.557)、植物乳杆菌(L.plantarum WCFS1)、副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌分别在12h、16h、16h、20h、20h时达到对数末期且分别在红霉素浓度为0.5 μg/mL、10 μg/mL、5μg/mL、1 μg/mL、1 μg/mL时生长受到明显抑制,2%的甘氨酸即可对这5株乳酸杆菌的细胞壁起到较好的弱化作用,有利于感受态细胞的形成。然后,在乳酸杆菌感受态细胞成功制备的条件下,试验通过温度处理、体内DNA修饰、体外DNA修饰这3种方法进一步研究了乳酸杆菌限制-修饰系统对于转化效率的影响。研究结果表明:适宜温度(50℃)处理乳酸杆菌可以明显提高一些菌株(L.plantarum 1.557、L.acidophilus 1.1878、L.delbrueckii subsp.bulgaricus 1.2161)的转化效率,电转入经乳酸乳球菌体内修饰的质粒可以明显提高一些菌株(L.plantarum 1.557、L.acidophilus l.1878、L.delbrueckii subsp.bulgaricus 1.2161)的转化效率。本研究为进一步构建乳酸杆菌表达系统以及为乳酸杆菌分子机制的研究和基因工程技术的发展,提供可行依据。