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目的帕金森病(PD)是世界上第二大神经退行性疾病。临床多出现静止性震颤、肌僵直、运动障碍等运动症状,使患者生活质量下降,目前研究发现其发病机制主要是由于脑内炎症反应、α突触核蛋白异常聚集甚至肠道微环境紊乱等多种原因引起的中脑多巴胺能神经元丢失,导致纹状体多巴胺分泌减少,引起的运动障碍性疾病。西药治疗PD多以补充多巴胺、延长多巴胺作用时间为主,但存在副作用大等问题。中医认为PD多为肝肾不足,因此认为以补益肝肾可达到治疗目的。杜仲方中以补肝肾,强筋骨的杜仲为君药,辅之石斛、地黄、干姜,兼有滋阴、散寒等功效。本研究拟在前期基础上进一步明确杜仲方治疗PD的药效作用,并分析其药效物质基础,鉴于小胶质细胞活化在PD发病中的重要作用,本研究重点对其入脑成分,从抑制小胶质细胞活化角度探究杜仲方脑保护作用机制,为PD的临床治疗及新药研发提供实验依据。方法本实验采用丙磺舒腹腔注射及MPTP皮下注射联合给药的方法建立PD小鼠模型。将实验动物随机分为正常组、模型组、杜仲方低(10g/kg)剂量组、杜仲方中(20g/kg)剂量组、杜仲方高(40g/kg)剂量组,造模同时每天灌胃给予不同浓度杜仲方提取液。每3.5天注射MPTP一次,连续注射10次,造模结束后继续给药1周。1杜仲方防治实验性小鼠PD的药效学研究首先,采用爬杆、转棒、悬挂等行为学实验方法分别在给药中期和末期检测小鼠运动协调能力;高效液相色谱-电化学检测法检测各组小鼠纹状体多巴胺及其代谢产物高香草酸、3,4-二羟苯乙酸的含量;采用免疫组织化学染色法检测各组小鼠酪氨酸羟化酶阳性细胞数量,评估杜仲方对帕金森病小鼠的治疗作用。2杜仲方体内移行成分研究在确定了杜仲方药效作用的基础上,采用UPLC-Q-MS/TOF对灌胃给予杜仲方的大鼠脑脊液、血液、尿液、粪便进行分析,寻找其进入体内的成分。3杜仲方入脑成分防治PD作用机制研究在明确杜仲方体内移行成分的基础上,本研究重点针对入脑成分开展体外药理实验,将分析得到的入脑成分作用于体外培养神经元,探究其神经保护作用及机制。采用MPP~+对神经细胞SH-SY5Y进行刺激,并予以不同浓度的6-姜酚、6-姜烯酚干预,检测其细胞毒性和细胞活力评估药效作用。体外培养BV2小胶质细胞,用LPS刺激小胶质细胞BV2,同时给予不同浓度的6-姜酚、6-姜烯酚进行干预,检测细胞活力和NO释放量;采用RT-PCR法检测给药干预的BV2细胞IL-6、IL-1β、TNFα、TGF-βm RNA表达水平;采用ELISA法检测BV2细胞上清IL-6、TNF-α含量,以评价6-姜酚、6-姜烯酚对LPS诱导BV2炎症状态的抑制作用。利用蛋白互作技术发现小胶质细胞炎性活化的关键靶点,并考察有效成分的潜在作用。结果1杜仲方对MPTP诱导的PD小鼠的药效作用造模给药中期及造模结束后,分别检测各组小鼠的行为学指标。结果发现:与正常组相比,不同时期模型组爬杆时间延长,转棒时间增加,悬挂得分减少,且有统计学意义,结果提示PD模型成功;与模型组相比,造模给药中期杜仲方高剂量(40g/kg)爬杆时间明显减少(P<0.05);其他各组行为学爬杆、转棒、悬挂较模型组有改善趋势,结果提示杜仲方具有一定改善PD行为学的药效作用。高效液相色谱-电化学检测结果显示:与正常组相比,模型组小鼠纹状体DA、HVA和DOPAC含量均明显减少(P<0.001),与模型组比较,杜仲方组DA、HVA有升高的趋势(P>0.05),DOPAC含量明显增加(P<0.001),结果提示杜仲方具有一定增加PD小鼠DA及其代谢产物水平的作用。免疫组织化学染色结果显示:与正常组相比,模型组TH阳性细胞数明显减少(P<0.05),与模型组相比,杜仲方中剂量组TH阳性细胞数明显增多(P<0.05),提示杜仲方具有保护DA能神经元的作用。2杜仲方进入体内的成分的鉴定对正常大鼠给予杜仲方灌胃给药,收集大鼠血浆、脑脊液、尿液和粪便。采用液质联用的方法进行分析,发现52种原型产物,其中脑脊液中发现6-姜酚、6-姜烯酚、石斛酮碱、石斛胺和Dendrobiumane A共5种成分。3入脑成分抑制LPS诱导的小胶质细胞炎症反应作用及机制研究采用MPP~+对神经细胞SH-SY5Y进行刺激,同时将入脑成分6-姜酚、6-姜烯酚对其进行干预,结果表明6-姜酚、6-姜烯酚无法改善MPP~+引起的SH-SY5Y细胞毒性和细胞活力的损伤。采用LPS激活小胶质细胞BV2,并将6-姜酚、6-姜烯酚对其进行干预,结果显示,与正常组相比模型组NO含量明显升高(P<0.001),与模型组相比,5μM、10μM的6-姜酚和2.5μM、5μM、10μM的6-姜烯酚NO生成明显降低,且有统计学意义,2.5μM的6-姜酚组较模型组NO含量降低,但无统计学意义。RT-PCR结果显示:与正常组相比,模型组促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-αm RNA表达水平升高,抑炎因子TGF-βm RNA表达水平明显降低;与模型组相比,2.5μM、5μM、10μM的6-姜酚和6-姜烯酚干预后均能明显降低IL-6、IL-1βm RNA表达水平,2.5μM、5μM、10μM 6-姜烯酚和5μM、10μM的6-姜酚组TNF-αm RNA表达水平明显降低;10μM 6-姜烯酚组抑炎因子TGF-βm RNA表达水平明显升高,且有统计学意义。ELISA结果显示:模型组细胞上清IL-6、TNF-α含量较明显升高(P<0.001),与模型组相比,2.5μM、5μM、10μM 6-姜烯酚和10μM 6-姜酚组细胞上清中IL-6含量明显降低,5μM、10μM 6-姜烯酚组细胞上清中TNF-α含量明显降低。蛋白互作结果显示Pomc在小胶质炎性活化过程中扮演了中演角色,进一步验证实验发现6-姜烯酚具有抑制小胶质细胞Pomc m RNA表达的作用。结论进一步确认了杜仲方对实验性小鼠PD有一定防治作用,其中入脑活性成分中6-姜酚和6-姜烯酚可能通过抑制小胶质细胞Pomc信号而抑制脑内炎症反应,可能是杜仲方防治PD的作用途径之一。