脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,恶性胶质瘤(WHO分类Ⅲ和Ⅳ级,其中Ⅳ级主要为胶质母细胞瘤,glioblastoma, GBM)约占所有胶质瘤的80%。胶质瘤预后差、易复发,严重影响患者生活和生存质量,其中GBM患者中位生存期在1年左右。尽管近年分子生物学和分子遗传学在胶质瘤发病机理研究中的取得初步进展,但仍不清楚胶质瘤的真正起始病因,还有待长期的深入研究。目前临床上通用的基于宏观组织形态学的胶质瘤WHO分类虽然经过各国科学家不断改进和完善,仍不能全面准确地反映胶质瘤的生物学行为及对放化疗的敏感性,也没有提供切实有效的生物治疗靶点。目前肿瘤分子分类,正逐步转向以分子病理特征为基础的新诊断体系,以期预测肿瘤对治疗的反应、预后、复发倾向等,并为个体化综合诊疗提供客观依据。因此,应用不断创新的生命科学理论与技术研究胶质瘤发生、发展和治疗抗性的机理以及分子病理特征和分子分型,并进一步探索新的诊断预后评估方案和有效治疗方法一直是当今胶质瘤领域的前沿课题。Wnt/p-catenin通路与信号转导及转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription3, STAT3)通路已被证明在胶质瘤的发生发展过程发挥着重要作用。这两个信号通路调控主要通过在细胞核内形成转录复合物与DNA结合调节下游靶基因的表达。其中Wnt信号通路的核心转录复合物为β-catenin/TCF4转录复合物,而STAT3通路核心转录复合物为磷酸化的STAT3二聚体。与正常脑组织相比,β-catenin和STAT3的表达水平与胶质瘤级别正相关。抑制β-catenin/TCF4和STAT3转录活性,均能有效降低胶质瘤细胞生长及侵袭能力,诱导细胞凋亡,以及抑制裸鼠皮下肿瘤生长。最近研究表明β-catenin/TCF4与STAT3之间存在着错综复杂的调控关系：交互转录调控,协同转录调控。因此,胶质瘤β-catenin/TCF4与STAT3间的调控关系以及相关的临床意义值得我们进一步深入探讨。本研究首先基于CHIP-Seq技术,从全基因组水平分析TCF4与STAT3的结合位点,研究β-catenin/TCF4与STAT3转录调控的特征,获得TCF4与STAT3共同调控的靶基因；接着引入西方人GBM表达谱数据以及国人GBM表达谱数据,综合运用生物信息学分析和统计分析方法,探讨TCF4和STAT3共同靶基因在GBM分型中指导作用,最终提出一种新的具有临床指导意义的GBM分子分型方法；最后研究TCF4和STAT3的共同靶基因EZH2与胶质瘤级别和预后的关系,分析EZH2与PRC2(Polycomb Repressive Complex2)其他成员及下游靶基因的关系,探讨EZH2与TCF4和STAT3间的调控关系。本课题第一部分采用CHIP (Chromatin immunoprecipitation,染色质免疫共沉淀)方法获得TCF4和STAT3结合的DNA,进行测序获得TCF4和STAT3的特异性short reads。进一步采用MACS方法,识别8307个TCF4潜在结合位点和6809个STAT3潜在结合位点。TCF4和STAT3潜在转录调控位点的染色体分布趋势较为相似,其中两者分布频率在5%以上的均主要位于染色体1、2、3、4、7上。编码基因上下游50kb的基因组分布分析发现,TCF4潜在转录调控位点有3%位于启动子区,2%位于外显子区,36%位于内显子区,22%位于远距离调控区；STAT3潜在转录调控位点有3%位于启动子区,2%位于外显子区,37%位于内显子区,21%位于远距离调控区。以上说明TCF4和STAT3能通过与远距离调控区结合调控潜在靶基因。保守结合序列Motif分析发现,TCF4和STAT3潜在转录调控位点序列分布富集于：ATCATACTAT和ATCAACATAT。比对基因组,识别1250个TCF4和STAT3共同调控的基因。Gene Ontology(GO)分析显示TCF4和STAT3共同调控的基因富集于细胞粘附、细胞代谢、神经发育、基因调控等。本课题第二部分引入TCGA的173例GBM表达谱数据(含11862个基因),与1250个TCF4和STAT3共同靶基因取交集,获得801个基因的GBM表达谱数据。分层聚类与一致性检验Kappa统计量结果示GBM可分成4个亚型,与TCGA4个GBM分子分型(Classical型、Mesenchymal型、Neural型和Proneural型)的一致性佳。提示TCF4和STAT3共同靶基因可以用于指导GBM的TCGA分型。为简化801个基因分型,采取TCGA4个亚型两两比较,获得与其他3个亚型均有统计学差异的基因列表,共132个。将TCGA173例GBM的132个基因表达谱数据进行分层聚类和Kappa统计量结果显示,GBM可分成4个亚型,与TCGA4个GBM分子分型的一致性佳。GO分析提示132个基因的特征与神经发育关系密切。引入小鼠的脑发育的转录组数据库,将TCGA的200个神经发育相关基因表达谱数据进行分层聚类和Kappa统计量分析发现GBM可分成4个亚型,与TCGA4个GBM分子分型的一致性显著。基于治疗反应特点和聚类分型特征,我们提出GBM的新分了分型方法：GBM可分为Mesenchymal-like亚型与Proneural-like亚型。从801个TCF4和STAT3共同靶基因筛选到142个差异基因,能很好的指导Mesenchymal-like亚型与Proneural-like亚型分型。Mesenchymal-like亚型与Proneural-like亚型两者在预后上没有明显差异,但是替莫唑胺(Temozolomide, TMZ)治疗后,Mesenchymal-like业型获益而Proneural-like亚型未获益。进一步引入260例GBM的表达谱数据,142个基因可以将260例GBM分成Mesenchymal-like亚型与Proneural-like亚型两类。最后引入220例国人胶质瘤的基因表达谱数据,证实胶质瘤中Mesenchymal-like亚型与Proneural-like亚型的存在。生存分析示,国人GBM的Mesenchymal-1ike亚型与Proneural-like亚型两者在预后上也没有明显差异,但是替莫唑胺治疗后,Mesenchymal-like亚型获益而Proneural-like亚型未获益,符合TCGA的结果。表明Mesenchymal-like亚型与Proneural-like亚型在西方人群与亚洲人群GBM患者中均存在,具有较好的临床治疗指导意义。本课题第三部分发现1250个TCF4和STAT3的共同靶基因EZH2表达与胶质瘤级别正相关。同时EZH2表达高,胶质瘤患者预后差。COX回归分析,结果提示EZH2表达水平是GBM患者预后的独立预测因子。相关分析发现EZH2表达与PRC2(Polycomb Repressive Complex2)其他两个核心元件SUZ12和EED表达呈现正相关。整合国外EZH2潜在靶基因的研究结果,筛选胶质瘤312个EZH2靶基因。GBM中EZH2表达越低,其靶基因的表达模式越接近正常脑组织。GO分析提示EZH2靶基因的特征与神经发育关系密切。进一步采用表达相关性分析,筛选到胶质瘤中228个EZH2相关基因。GBM中EZH2表达越低,其相关基囚的表达模式越接近正常脑组织。GO分析提示EZH2相关基因的特征与细胞周期与分裂、DNA复制与修复等细胞核内活动关系密切。体外细胞周期实验显示,采用RNA干扰下调EZH2表达后,胶质瘤细胞周期呈现G0/G1期阻滞。皮下裸鼠荷瘤模型也表明敲低EZH2表达后,肿瘤体积生长受到抑制。进一步研究发现,分别采用小分子抑制剂FH535和WP1066来抑制β-catenin/TCF4与STAT3的转录活性,EZH2表达下降。而下调EZH2表达能抑制β-catenin与STAT3的表达。皮下裸鼠荷瘤组织免疫组化结果显示,敲低EZH2表达抑制β-catenin与STAT3的表达。综上所述,本研究是第一次采用CHIP-Seq技术从全基因组水平解析TCF4和STAT3在胶质母细胞瘤中的转录调控机制以及与胶质母细胞瘤分子分型的关系。具有以下3个重要意义：(1)发现TCF4和STAT3除了与启动子区结合外,还能通过与远距离调控区结合调控潜在靶基因。TCF4和STAT3转录调控存在相似性,可通过协同转录来调节下游靶基因。上述结果将为深入研究TCF4和STAT3在胶质瘤发生发展中的机制奠定基础,同时也为研究其他转录因子的转录调控机制提供技术和理论的参考依据。(2)揭示TCF4和STAT3共同驱动GBM的TCGA分子亚型的形成,TCF4和STAT3共同靶基因能有效指导TCGA分型。同时神经发育相关基因可能在GBM的发生发展与GBM分子亚型的形成过程起着关键作用。最为重要的是,提出具有临床指导意义的GBM新分子分型(Mesenchymal-like亚型与Proneural-like亚型)。GBM的Mesenchymal-like亚型与Proneural-like亚型两者在预后上没有明显差异,但是给予替莫唑胺治疗后,Mesenchymal-like亚型获益而Proneural-like亚型未获益。GBM新分子分型的提出,将有效指导GBM的个体化综合治疗,为分子病理指导下的胶质瘤个体化治疗策略提供了可靠的临床参考。(3)发现EZH2与胶质瘤级别和预后相关,在胶质瘤发生发展过程起了重要作用。通过整合分析,筛选到一批EZH2的靶基因和相关基因。β-catenin/TCF4与STAT3信号通路与EZH2信号间存在正反馈调控关系。研究结果有助于寻找胶质瘤诊断评估和预后判断等标记物和治疗靶点,为揭示胶质瘤发生发展机理和优化治疗策略提供了参考依据。