目的：　　树突状细胞(Dendritic cell，DC)作为机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，处于启动、调控、维持免疫应答的中心环节，诱导天然免疫应答是它独特的功能，是连接天然免疫和适应性免疫的桥梁。　　已有研究发现，HIV感染后，血液中的DC细胞数量明显下降，并且在慢性HIV感染中，pDC水平与血浆病毒载量呈负相关，减少的pDC数量与HIV疾病进展和发生机会性感染密切相关，但目前pDC数量下降的机制仍不明确。另外，HIV感染者体内mDC数量也是下降的。尽管DC亚群数量减少，但仍能通过上调成熟标志、产生促炎细胞因子/炎症趋化因子和有效刺激同种基因T细胞增殖，对TLR7/8的刺激作出有效应答。HIV感染以后pDC高表达TRAIL，并且上调活化CD4+T细胞TRAILR1的表达，导致了CD4+T细胞对于TRAIL依赖的pDC介导的细胞死亡易感，抗病毒治疗可上调CD4+T上凋亡抑制受体TRAIL R4的表达，因此可预测DC与疾病进展有密切联系。并有体外实验报道说HIV(+)pDC产生大量的IFN-α调节着CD4+T细胞TRAIL的表达，因而促进了CD4+T细胞的死亡，直接参与了HIV的发病机制。另有研究发现，病毒感染以后（如HIV、HBV、HCV）IFN-α通过内部凋亡途径负向调节着pDC的数量。综上所述，外周血中DC数量的减少与凋亡有一定的关系，我们可以推测DC对于控制HIV复制发挥着重要作用，在促进疾病进展中扮演着重要角色。　　目前，国内外对于HIV感染后DC凋亡的研究较少，Laforge等人对体外DC分化过程中HIV感染后凋亡情况的研究表明，HIV易于使单核起源的巨噬细胞和树突状细胞（MDDC）凋亡，并高表达TRAIL和FasL。研究发现，外部凋亡途径如FasL、TRAIL与受体Fas、TRAIL Rs结合后会导致死亡诱导的信号复合物DISC（包括FADD、TRADD、procaspase-8）的形成，接着会导致caspase-8(FLICE)的活化，这时如果细胞有足够的caspase-8，它直接活化效应caspase，促使CAD(caspase-activated DNase)形成，进而DNA片段化;如细胞没有足够的caspase-8，则它会裂解Bcl-2家族Bid成为tBid，然后tBid转移到线粒体上与Bcl-2家族促凋亡因子Bax、Bak结合，启动凋亡内部途径。两种途径都会导致细胞色素c的释放，在包浆内与凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）和procaspase-9结合形成凋亡小体，它会导致caspase-9活化，接着caspase-3被活化，形成caspase级联反应，从而诱导凋亡的形成。但是，这些分子的表达在中国男男同性恋HIV感染者中是如何变化的，以及它们之间变化的关系如何，对DC凋亡影响如何，在疾病进展中的作用如何，是否可以作为治疗的靶点，目前国内外尚未见报道。本课题拟对中国男男同性恋HIV-1感染者DC凋亡的标志、凋亡受体与配体分子进行检测以及调节凋亡的一些关键分子进行研究，并对CD4+T细胞凋亡和DC凋亡的关系进行进一步探索，探讨HIV-1感染者DC凋亡机制，揭示中国HIV感染者DC凋亡在疾病进展中的作用，为进一步阐明HIV-1的致病机制以及发现新的治疗靶点提供新的思路。　　方法：　　1、研究对象　　HIV-1慢性感染者(chronic HIV-1 infection，CHI)31例，均来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊，经免疫印迹试验确认为阳性，平均年龄29.5(23-47)岁。入选标准:中国男男性接触感染者，感染时间均在两年以上。其中29例未接受抗病毒治疗，2例已经接受抗病毒治疗。　　10例健康对照为随机抽取的HIV抗体阴性、未暴露于HIV、无免疫系统疾病、无HCV与HBV感染的健康人，性别、年龄均与研究对象匹配，平均年龄为25(23-30)岁。　　2、DC凋亡标志的检测　　向流式管中依次加入肝素抗凝全血150ul，4ml自配溶血素，混匀，室温避光溶血10min，溶血后离心350g、7min、55，弃上清，重旋细胞，加3ml2％ FBS，离心350g、7min、55，共2次，弃上清，重旋细胞，在100ul体系中表面染色，每管中加入相应的荧光抗体组合，混匀，4℃冰箱避光孵育30分钟。孵育后，每管加入2ml PBS重悬，离心350g，7min，55，弃上清，再用2ml冷的PBS洗一次，弃上清，用试剂盒内buffer(1∶10)重旋细胞，使之体积为100ul，加入AnnexinV&7-AAD各5ul，室温避光孵育15min，孵育后，每管加入200ul buffer，应用LSRⅡ流式细胞仪进行检测，BD FACSDivaTM软件分析结果。　　3.DC死亡受体和配体、CCR7的检测　　操作同上，每管加入相应的表面荧光抗体组合，4℃冰箱避光孵育30分钟。孵育后每管加2mlPBS，350g，7min，55。弃上清，重悬细胞后加入含1％多聚甲醛的固定液200μl，混匀后，应用LSRⅡ流式细胞仪进行检测，BD FACSDivaTM软件分析结果。　　4、DC凋亡途径中Bcl-2、caspase-3的检测　　表面染色后，Bcl-2管加入250ui Cytofix/Cytoperm solution，4℃破膜20分钟;caspase-3管加入配套的500ul Cytofix/Cytoperm solution，冰上破膜20分钟。破膜时配置洗液，用去离子水以1∶10倍稀释洗液。破膜后，用配置好的洗液洗涤，500g，5min，55。离心后加入胞内染料，室温避光孵育30分钟。孵育后每管加1ml洗液洗涤，500g，5 min，55。弃上清，重悬细胞后加入含1％多聚甲醛的固定液200μ l，混匀后，应用LSRⅡ流式细胞仪进行检测，BD FACSDivaTM软件分析结果。　　5、CD4+T细胞凋亡及TRAIL DR4、DR5的检测　　操作同上，每管中加入相应的荧光抗体组合，4℃冰箱避光孵育30分钟。孵育后每管加2mlPBS，350g，7min，55。弃上清，重悬细胞后加入含1％多聚甲醛的固定液200μ l，混匀后，应用LSRⅡ流式细胞仪进行检测，BD FACSDivaTM软件分析结果。　　6、CD4+T细胞绝对值的检测　　将20μl BD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP试剂加入绝对计数管中，逆向加入50μl混匀的抗凝全血，室温避光染色15分钟，加入1×免洗溶血素450μl，室温避光溶血15分钟，应用FACS Calibur流式细胞仪及MultiSET软件检测并分析得到CD4+T淋巴细胞的绝对值。　　7、HIV病毒载量测定　　取1ml EDTA抗凝血浆，采用Roche公司COBAS(@)AmpliPrep(@)/COBAS(@)TaqMan(@)System自动载量仪上以实时荧光定量PCR方法测定病毒载量。全部操作按照操作说明书进行。　　8、统计学分析　　应用SPSS17.0和Graphpad5.0软件包进行统计分析和图形制作，所有数据以中位数表示，两组间实验指标的比较采用Mann-Whitney U检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，P＜0.05为有统计学意义。　　结果：　　一、HIV-1慢性感染者外周血pDC、mDC数量:　　HIV-1慢性感染者外周血中pDC的百分数(5.88;1.4-13.6)显著低于健康对照(12.65;4.4-18.8)(P=0.0002)。　　HIV-1慢性感染者外周血中mDC的百分数(23.28;9-48.9)显著低于健康对照(36.93;24.8-55)(P=0.0006)。　　二、HIV-1慢性感染者外周血pDC、mDC凋亡数量以及mDC凋亡与VL的关系:　　HIV-1慢性感染者外周血中Annexin-Ⅴ+7-AAD-pDC的百分数(7.18;0.7-18.1)与健康对照（5.35;3.0-8.3）(P=0.148)相比无统计学意义。　　HIV-1慢性感染者外周血中Annexin-Ⅴ+7-AAD-mDC的百分数(6.01;0.6-15.5)显著高于健康对照(2.9;1.3-4.7)(P=0.036)。　　HIV感染者外周血中mDC凋亡与VL呈正相关(p=0.004，r=0.534)。　　三、HIV-1慢性感染者外周血pDC、mDC凋亡受体和配体的表达:　　HIV-1慢性感染者pDC Fas的表达(3.65;0-19.4)与健康对照（1.11;0-3）(P=0.086)相比无统计学意义;mDC Fas的表达（7.73;0-41.8）与健康对照（2.68;0.1-9.8）(P=0.135)相比无统计学意义。　　HIV-1慢性感染者pDC DR4的表达（1.75;0-5.7）与健康对照（0.9;0-1.8）(P=0.365)相比无统计学意义;mDC DR4的表达(5.88;0.3-30.6)显著高于健康对照(1.48;0.5-2.4)(P=0.043)。　　HIV-1慢性感染者pDC DR5的表达（4;0-29）与健康对照（0.63;0-1.9）(P=0.175)相比无统计学意义;mDC DR5的表达(9.63;0-53)与健康对照(3.95;0.3-8.3)(P=0.395)相比无统计学意义。　　HIV-1慢性感染者pDC TRAIL的表达(8.2;0.7-21.2)与健康对照(10.2;2-28.9)相比无统计学意义(P=0.421); mDC TRAIL的表达(15.12;2.8-44.9)与健康对照相比(18.14;0.8-68.4)无统计学意义(P=0.479)。　　四、HIV-1慢性感染者外周血pDC、mDC凋亡通路中Bcl-2、caspase-3的表达:　　HIV-1慢性感染者pDC Bcl-2的表达(1.07;0-13)与健康对照（0.93;0-2.9）相比无统计学意义(P=0.373); mDC Bcl-2的表达(1.07;0-3.6)与健康对照(0.8;0.1-1.8)相比无统计学意义(P=0.606)。　　HIV-1慢性感染者pDC caspase-3的表达(2.6;0-12.2)与健康对照(1.53;0-3.7)相比无统计学意义(P=0.573); mDC caspase-3的表达(5.97;0.2-22.8)与健康对照（3.97;0.0-8.6）相比无统计学意义(P=0.499)。　　五、HIV-1慢性感染者外周血pDC、mDC CCR7的表达:　　HIV-1慢性感染者pDC CCR7的表达(8.9;0-40)与健康对照(6.4;0.5-28.9)相比无统计学意义(P=0.563)。　　HIV-1慢性感染者mDC CCR7的表达(18.44;0-86.9)与健康对照(15.4;1-72.2)相比无统计学意义(P=0.431)。　　六、HIV-1慢性感染者外周血CD4+T细胞凋亡数量、 DR4、DR5的表达:　　HIV-1慢性感染者CD4的凋亡(7.71;2.8-25.8)显著高于健康对照(3.47;1.7-6.3)(P=0.001)。　　HIV-1慢性感染者CD4+T DR4的表达（6.6;0.8-16.6）与健康对照(6.69;0.5-15.9)相比无统计学意义(P=0.641); CD4+T DR5的表达(3.6;0.6-10）与健康对照(2.23;0.5-6)相比无统计学意义(P=0.082)。　　HIV感染者外周血中pDC的凋亡与CD4凋亡呈正相关(p=0.013，r=0.458)。　　HIV感染者外周血中pDC、mDC TRAIL的表达均与CD4凋亡均无相关性(P=0.618，P=0.208)。　　结论：　　1、HIV-1慢性感染者外周血中，mDC凋亡明显增加，pDC凋亡不增加，提示两种亚现不同的亡水平。　　2、HIV-1慢性感染者外周血中mDC DR4表达上调，提示可能是导致其凋亡的原因。　　3、HIV-1慢性感染者外周血中DC淋巴结迁移标志-CCR7表达不增加，提示淋巴结迁移可能不是DC数量减少的原因。