疟疾主要是经携带疟原虫的按蚊叮咬后引起的一种高发病率且对人体的多个器官都具有致病作用的虫媒传染病,多发于非洲及亚热带地区。青蒿素被世界卫生组织(WHO)批准为世界范围内脑型医治疟疾和恶性疟疾的首选药物,但因青蒿素的一些不良药代动力学特性以及像氯喹一样可能出现的耐药性问题,同时为了提高治愈率,缩短疗程,WHO提倡青蒿素联合疗法(ACT)。但是,黄花蒿中青蒿素含量低、提取流程复杂,以及ACT中联用抗疟药价格昂贵,严重阻碍了青蒿素类产品在抗疟剂方面的应用。由此,一些科研工作者开始研究黄花蒿植物疗法,包括茶剂和干叶口服,也称为以植物为基础的ACT疗法。研究证明黄花蒿植物中含有多种抗疟活性成分以及对青蒿素产生增效作用的成分。尽管由于剂量无法控制以及组分复杂等问题,尚不支持该茶剂用于治疗疟疾,但是在一些疟疾流行的发展中国家,茶饮已经被用于疟疾的预防和治疗。但在使用的过程中也发现了以下问题:单次服用后效果显著,多次服用之后复发快,停用一段时间后再服用又重新具有疗效。因此,我们推断可能是黄花蒿茶剂中存在的多种化学成分之间产生了代谢性相互作用导致了这种现象的出现。细胞色素P450酶是人体中最主要的药物代谢酶,此中的CYP3A4和CYP2B6具有较高的诱导性,核受体是含量最丰富的转录调节因子之一,孕烷X受体(PXR)是介导CYP3A4/2B6诱导的主要核受体,组成型雄甾烷受体(CAR)同样也是。从核受体调控的角度来考虑代谢性相互作用的机理是十分必要的。本研究采用报告基因法在体外对黄花蒿中经PXR和CAR对CYP3A4/2B6产生诱导作用的组分进行筛选,为以黄花蒿植物为基础的青蒿素联合疗法提供部分理论和实验基础。综述如下:1.pGL3-CYP2B6-Luc 质粒的构建本章根据相关文献完成了 pGL3-CYP2B6-Luc质粒的构建。首先合成人类CYP2B6的远端和近端启动子的序列,随后插入到pGL3-basic报告基因的上游,得到构建好的pGL3-CYP2B6-Luc 质粒。2.双荧光素酶报告基因体系的建立和优化本章应用上述构建好的pGL3-CYP2B6-Luc的报告基因质粒以及本实验室已有的pcDNA3.1(+)-hPXR、pcDNA-hCAR3、pcDNA3.1(+)、pGL3-control、pRL-TK 以及pGL3-CYP3A4-Luc质粒,建立了基于hPXR/hCAR3的CYP3A4/2B6的体外报告基因筛选模型。以瞬时转染方式将表达质粒、报告基因质粒以及内参质粒转染进HepG2细胞中,分别以hPXR的经典激动剂利福平以及hCAR3的经典激动剂CITCO对CYP3A4/2B6的诱导倍数作为评价指标,对各个通路进行验证,并通过优化得到各质粒的最适比例最终构建得到了 4条通路的筛选模型,将其用于黄花蒿提取物的筛选。3.报告基因法研究黄花蒿各部分提取物对hPXR/hCAR3介导的CYP3A4/2B6转录调节作用采取构建好的双荧光素报告基因模型,以DMSO也就是空白溶剂作阴性对照,以对应的阳性药物作阳性对照,黄花蒿提取物刺激细胞48小时后进行双荧光素酶活性测定,结果表明,包括50%,85%,Total在内的几个分段提取物均能在不同程度上通过PXRwt诱导CYP3A4的表达,PE以及EtoAc的提取物也有较强的激活效应,同时,粗提物基质量的多少也会对这种激活效应产生影响。此外,对单体化合物的进一步筛选发现Arteannuin A具有较强的激活效应,Arteannuin B仅表现出微弱的激活作用。进一步的研究发现,Arteannuin A和Arteannuin B通过PXR的五种突变体对CYP3A4/2B6的诱导作用是不同的,说明PXR的基因多态性影响了 PXR对CYP3A4/2B6的这种调控作用。此外,基于CAR的CYP3A4/2B6研究发现,Arteannuin A和Arteannuin B也可以在一定程度上激活CAR,从而对CYP3A4/2B6产生诱导作用。4.蛋白、基因水平以及计算机模拟对Arteannuin A与Arteannuin B的验证通过分别检测CYP3A4/2B6的基因表达、蛋白表达来验证Arteannuin A与Arteannuin B是否能够诱导CYP3A4/2B6。药物处理HepG2细胞48h,提取细胞蛋白与RNA,按操作进行Western blot与real-time PCR检测CYP3A4/2B6的蛋白及基因表达量变化。结果显示,Arteannuin A和Arteannuin B对CYP3A4/2B6产生了程度不同的诱导作用,与报告基因的结果类似。分子对接结果表明,Arteannuin A和Arteannuin B均能够容纳在PXR/CAR LBD的配体结合腔内,氢键以及疏水性作用力的差别可能是造成二者激活效应不同的原因。