Nudix水解酶(Nudix hydrolase,Nd)是一种广泛存在于多种生物体内的一种水解酶。它可以水解多种有机焦磷酸盐,包括核苷二磷酸盐、核苷三磷酸盐、二核苷酸多磷酸盐、二磷酸肌醇多磷酸盐、核苷酸糖和RNA帽端。本实验室的前期研究发现旋毛虫Nudix水解酶(Trichinella spiralis Nd,Ts Nd)与旋毛虫侵入小鼠小肠上皮细胞(IEC)有关。本研究通过RNA干扰(RNAi)技术研究旋毛虫肌幼虫的Ts Nd基因功能,观察Ts Nd基因被沉默后旋毛虫幼虫在体外的存活情况、感染能力和雌虫生殖力。首先设计与Ts Nd同源的ds RNA和si RNA,通过浸泡法和电穿孔法将其导入到旋毛虫肌幼虫体内。然后通过Real-time PCR技术和Western blotting技术分别幼虫Ts Nd基因转录水平和蛋白表达水平的变化。结果发现,ds RNA和si RNA均能导致Ts Nd表达明显降低。同时设计一条与旋毛虫蛋白酶体β7亚基(Tspst)同源的ds RNA,用来验证RNAi具有基因特异性,即ds RNA-Ts Nd和ds RNA-Tspst只能分别引起与它们同源的基因沉默。将ds RNA-Ts Nd和si RNA导入旋毛虫肌幼虫体内后,在培养过程中观察幼虫存活情况。体外观察Ts Nd基因沉默对旋毛虫幼虫侵入IEC的影响,动物实验观察Ts Nd基因沉默对旋毛虫幼虫在体内侵入肠粘膜及其发育和生殖力的影响。材料与方法1.材料本实验所用旋毛虫(T.spiralis,T1)由昆明小鼠保种和传代。p GEM-T-Ts Nd/M109:含旋毛虫Ts Nd基因重组质粒菌株,由实验室前期构建和保存。p MAL-C2X-Tspst/BL21:含旋毛虫Tspst基因重组质粒菌株,由实验室前期构建和保存。实验用BALB/c小鼠:购自河南省实验动物中心。2.ds RNA和si RNA的设计与合成登陆Gen Bank查询Ts Nd和Tspst的m RNA序列。①ds RNA的设计与合成;选取Ts Nd m RNA 650~1301bp和Tspst m RNA 88~742bp作为2条ds RNA的靶序列。根据靶序列设计含有T7启动子的PCR引物,以含Ts Nd和Tspst的重组质粒为模板PCR扩增得到含T7启动子的PCR产物,即ds RNA体外转录模板,然后体外转录合成ds RNA-Ts Nd和ds RNA-Tspst。②si RNA的设计与合成:根据Ts Nd m RNA序列,设计3个si RNA和1个对照si RNA,根据si RNA靶向m RNA的位点,分别命名为si RNA-275、si RNA-425、si RNA-715和对照si RNA,用FAM荧光标记对照si RNA,以便在转染过程中跟踪si RNA。3.将ds RNA和si RNA导入旋毛虫肌幼虫体内应用浸泡法和电穿孔法,分别将20、40或60 ng/μL ds RNA,1、2或3μM si RNA和Control si RNA分别导入旋毛虫幼虫体内,其中对照si RNA组旋毛虫幼虫可以在荧光显微镜下观察荧光信号,以确定si RNA是否被成功导入到旋毛虫肌幼虫体内。4.RNAi对Ts Nd基因转录与表达水平的影响利用Real-time PCR和Western blotting分别检测ds RNA和si RNA处理后幼虫Ts Nd基因转录和蛋白质表达水平的变化。5.RNAi对Ts Nd基因干扰的特异性分析用浸泡法分别将40ng/μL ds RNA-Ts Nd和ds RNA-Tspst导入旋毛虫肌幼虫体内,检测2组旋毛虫肌幼虫中Ts Nd和Tspst表达水平的变化。6.Ts Nd基因沉默后对幼虫体外存活及侵入IECs的影响利用浸泡法和电穿孔法,将ds RNA、si RNA和对照si RNA分别导入到旋毛虫肌幼虫体内后,观察幼虫体外死亡率。将100条经过1、1.5、2、2.5、3μM si RNA-275或20、30、40、50、60ng/μl ds RNA-Ts Nd电穿孔处理后18h的肌幼虫与500μl半固体培养基混匀后接种到24孔板中的IECs单层上。37℃、5%CO2孵育2h后观察幼虫侵入率。7.Ts Nd基因沉默对旋毛虫侵入肠粘膜及其发育和生殖力的影响将160只BALB/c小鼠分为8组(每组20只):ds RNA浸泡法3组(ds RNA-Ts Nd处理组、转染试剂Lip2000和PBS对照组)、ds RNA电穿孔法2组(ds RNA处理组和PBS对照组及si RNA电穿孔法3组(si RNA-275处理组、对照si RNA处理组和PBS对照组)。将Ts Nd基因沉默后的幼虫经口感染小鼠(300条幼虫/只)。感染后6d后剖杀10只小鼠收集成虫,感染后35d后剖杀另外10只小鼠收集肌幼虫,计算肠道成虫荷和肌幼虫荷及其减虫率。将收集的成虫进行体外培养72h,收集新生幼虫,计算雌虫体外72h新生幼虫产量,作为成虫生殖力指标。雌虫体外72h新生幼虫产量=72h新生幼虫数/雌虫数。结果1.ds RNA和si RNA的导入:琼脂糖凝胶检测结果,发现2个清晰条带:ds RNA-Ts Nd(691bp)和ds RNA-Tspst(694bp),结果与预期大小相同。2.荧光标记跟踪结果显示,通过电穿孔法将对照si RNA导入到幼虫18h后,在荧光显微镜下发现幼虫体内有明显的荧光,而未处理的幼虫则无荧光。3.ds RNA对旋毛虫肌幼虫Ts Nd转录和表达水平的影响(1)用浸泡法将20、40和60 ng/μl ds RNA-Ts Nd导入幼虫后1d,Real-time PCR结果显示,20、40和60 ng/μl ds RNA-Ts Nd处理组Ts Nd m RNA表达量相对于PBS对照组分别为48.7%、34.7%和29.5%,表达量的降低具有统计学意义(P<0.05);lip2000对照组与PBS对照组之间Ts Nd m RNA表达量没有明显变化(P>0.05)。(2)用浸泡法将40ng/μl ds RNA-Ts Nd导入幼虫后1d、2d、3d、4d、5d和6d时,Real-time PCR结果显示,ds RNA处理组Ts Nd m RNA表达量相对于PBS对照组分别为34.2%、42.7%、52.3%、57.7%、79.7%和86.2%(F1d=7.429,F2d=0.013,F3d=0.016,F4d=10.002,F5d=5.173,F6d=0.715;P<0.05);lip2000对照组与PBS对照组之间Ts Nd m RNA表达量没有明显变化(P>0.05)。Western blotting结果显示,相对于PBS对照组,ds RNA-Ts Nd处理组在浸泡处理后第1d、2d、3d、4d、5d、6d时,Ts Nd表达量分别为101.2%、78.7%、43.6%、44.3%、89.2%、100.6%。而lip2000对照组相对于PBS对照组Ts Nd表达量没有明显变化。电穿孔处理后3d,ds RNA-Ts Nd处理组Ts Nd表达量相对于PBS对照组为41.8%。(3)电穿孔法将40ng/μl ds RNA导入幼虫后1d,与PBS对照组相比,Ts Nd m RNA表达量降低了74.2%(F=7.033,P<0.05)。4.si RNA对旋毛虫肌幼虫Ts Nd转录和表达水平的影响(1)通过电穿孔法将2μM si RNA-275、si RNA-425或si RNA-715导入到旋毛虫肌幼虫体内后1d,si RNA-275、si RNA-425和si RNA-715处理组幼虫Ts Nd基因转录水平相对于PBS对照组分别为26.7%、77.4%和83.7%(P<0.05)。Control si RNA处理组幼虫Ts Nd基因转录水平与PBS对照组相比没有明显差异(P>0.05)(4.7 A)。Western blotting结果显示,与PBS对照组相比,si RNA-275、si RNA-425和si RNA715处理组Ts Nd表达量分别为23.3%、79.5%和94.8%。对照si RNA处理组Ts Nd表达量相对于PBS对照组无明显变化(P>0.05)。(2)通过电穿孔法将1μM、2μM或3μM si RNA-275导入到旋毛虫肌幼虫体内后1d,1μM、2μM和3μM si RNA-275处理组幼虫Ts Nd基因转录水平相对于PBS对照组分别为48.0%、27.7%和19.2%(P<0.05)。Control si RNA处理组幼虫Ts Nd基因转录水平与PBS对照组相比没有明显差异(P>0.05)(4.7 B)。(3)通过电穿孔法将2μM si RNA-275导入到旋毛虫肌幼虫体内后1d、3d、5d和7d,幼虫Ts Nd基因转录水平相对于PBS对照组分别为27.7%、39.3%、49.7%和57.9%(P<0.05)。Control si RNA处理组幼虫Ts Nd基因转录水平与PBS5.RNAi对Ts Nd基因干扰的特异性分析用浸泡法分别将ds RNA-Ts Nd和ds RNA-Tspst导入幼虫体内后,Real-time PCR结果显示,ds RNA-Ts Nd处理组与PBS对照组相比,Ts Nd m RNA表达量降低了74.6%(P<0.05),而Tspst m RNA表达量无明显变化(P>0.05)。ds RNA-Tspst处理组与PBS对照组相比,Ts Nd m RNA表达无明显变化(P>0.05),而Tspst m RNA表达量降低了73.2%(P<0.05)。Western blotting分析显示,与PBS空白对照组相比,ds RNA-Ts Nd处理组Ts Nd表达量降低了62.9%(P<0.05),Tspst表达量则没有明显变化(P>0.05);而ds RNA-Tspst处理组Ts Nd表达量没有明显变化(P>0.05),而Tspst表达量则降低了60.6%(P<0.05)。结果表明,RNAi对Ts Nd基因转录和表达水平的干扰均具有特异性。6.ds RNA和si RNA对旋毛虫体外存活的影响ds RNA浸泡法处理组、Lip2000和PBS对照组的幼虫死亡率分别为32.2%、34.2%和33.6%(χ2=0.138,P>0.05)。ds RNA电穿孔处理组和PBS组的幼虫死亡率分别为35.2%和33.1%(χ2=0.116,P>0.05)。si RNA电穿孔处理后,si RNA-275处理组、对照si RNA处理组和PBS对照组幼虫死亡率分别为33.1%、32.3%和31.9%(χ2=0.024,P>0.05)。7.Ts Nd基因沉默对旋毛虫体外侵入IECs的影响(1)浸泡法将20、30、40、50、60ng/μl ds RNA-Ts Nd导入到旋毛虫肌幼虫体内18h后,观察幼虫体外对IECs的侵入,结果发现20、30、40、50、60ng/μl ds RNA-Ts Nd处理组、Lip2000和PBS对照组幼虫侵入率分别为54.4%,44.7%,39.2%,35.3%,32.7%,61.7%和63.1%。30、40、50、60ng/μl ds RNA-Ts Nd处理组幼虫侵入率与Lip2000和PBS对照组相比明显降低(χ230=6.640,χ240=10.982,χ250=16.778,χ260=19.317;P<0.05)。幼虫侵入率与ds RNA-Ts Nd浓度呈负相关(r=-0.96798)。(2)电穿孔法将20、30、40、50、60ng/μl ds RNA-Ts Nd导入到旋毛虫肌幼虫体内后,观察幼虫体外对IECs的侵入,结果发现20、30、40、50、60ng/μl ds RNA-Ts Nd处理组和PBS对照组幼虫侵入率分别为52.6%,43.8%,39.5%,33.8%,30.8%和58.3%。30、40、50、60ng/μl ds RNA-Ts Nd处理组幼虫侵入率与PBS对照组相比明显降低(χ230=4.258,χ240=7.044,χ250=12.956,χ260=16.099;P<0.05)。幼虫侵入率与ds RNA-Ts Nd浓度呈负相关(r=-0.98707)。(3)电穿孔法将1、1.5、2、2.5、3μM si RNA-275导入到旋毛虫肌幼虫后,观察幼虫体外对IECs的侵入,结果显示1、1.5、2、2.5、3μM si RNA-275处理组、control si RNA处理组和PBS对照组幼虫侵入率分别为50.3%,42.6%,37.0%,33.6%,30.6%,59.4%和58.3%。1.5、2、2.5、3μM si RNA-275处理组幼虫侵入率与control si RNA处理组和PBS对照组相比明显降低(χ21.5=5.873,χ22=5.873,χ22.5=5.873,χ23=5.873;P<0.05)。幼虫侵入率与ds RNA-Ts Nd浓度呈负相关(r=-0.97941)。8.Ts Nd基因沉默对旋毛虫侵入肠粘膜及其发育和生殖力的影响(1)ds RNA浸泡法:ds RNA处理组的成虫荷(71.4±16.0条)明显低于Lip2000对照组(140.2±14.9条)和PBS对照组(142.6±20.2条)(P<0.05);Lip2000对照组的成虫荷与PBS对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);3组成虫体外72h新生幼虫产量分别为51.3±2.6、50.8±3.1及53.7±2.6(P>0.05)。ds RNA处理组的肌幼虫荷为5805±1815条/g,明显低于Lip2000对照组的9363±3130条/g和PBS对照组的9624±3624条/g(P<0.05);而2个对照组肌幼虫荷的差异无统计学意义(P>0.05)。与PBS对照组相比,ds RNA处理组的成虫和肌幼虫减虫率分别为49.9%和39.9%。(2)ds RNA电穿孔法:ds RNA处理组肠道成虫荷为38.4±9.6条,明显低于PBS对照组的113.5±18.8条(F=23.261,P<0.05);2组成虫体外72h新生幼虫产量分别为72.3±6.1与78.3±6.9(P>0.05)。ds RNA处理组肌幼虫荷为1943±97条/克,明显低于PBS对照组的6376±1197条/克(F=42.475,P<0.05)。ds RNA处理组的成虫和肌幼虫减虫率分别为83.4%和69.5%。ds RNA电穿孔法的成虫与肌幼虫减虫率均明显高于ds RNA浸泡法(χ2成虫=24.442,χ2肌幼虫=17.419;P<0.05)。(3)si RNA电穿孔法:si RNA-275处理组的肠道成虫荷为37.3±10.2条,明显低于对照si RNA处理组的109.6±9.7条(P<0.05)和PBS对照组的102.5±20.1条(P<0.05),而对照si RNA处理组与PBS对照组成虫荷之间的差异无统计学意义(P>0.05);3组成虫体外72h新生幼虫产量分别为70.7±3.5、74.1±6.6及72.8±4.7(P>0.05)。si RNA-275处理组的肌幼虫荷为1765±360条,明显低于对照si RNA处理组的6066±967条(P<0.05)和PBS对照组的5654±1422条(P<0.05),而对照si RNA处理组与PBS对照组之间肌幼虫荷的差异无统计学意义(P>0.05)。si RNA-275处理组的成虫和肌幼虫减虫率分别为63.6%和68.8%。结论1.通过体外转录成功合成了旋毛虫ds RNA-Ts Nd和ds RNA-Tspst。2.ds RNA浸泡法和电穿孔法均可导致Ts Nd转录与表达水平的下降,对Ts Nd基因的干扰具有特异性;si RNA电穿孔法亦可明显降低Ts Nd的转录与表达水平。3.应用ds RNA与si RNA沉默Ts Nd基因后,旋毛虫肌幼虫的体外存活率无明显变化。4.Ts Nd基因沉默能显著抑制幼虫在体外对IECs的侵入。5.沉默Ts Nd基因可明显影响幼虫对肠粘膜的侵入和发育,肠道成虫与肌幼虫荷明显降低。