食管癌中差异表达关键基因的筛选及相关功能研究

来源 :河北医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hellobluejay
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我国是食管癌高发国家,发病和死亡人数占全球的一半以上。由于早期诊断困难,大多数食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)患者在确诊时已经处于疾病的中晚期,这也是我国食管癌总体5年生存率不高的主要原因。为了提高食管癌患者的生存,寻找诊断及预后的生物标志物和治疗靶点是目前临床中迫切需要解决的问题。大量的研究表明,食管癌的发生发展是多阶段、多基因参与、多种因素共同作用的过程,其确切的发病机制并不清楚。国内外已有大量应用基因表达谱和高通量转录组技术分析食管癌相关基因的报道。这为食管癌相关诊断分子标志物的发现提供了很好的研究方向。表观遗传修饰,如DNA甲基化,已经被广泛研究并用于肿瘤的诊断和治疗。异常高甲基化与多种肿瘤类型中肿瘤相关基因的失活有关。因此,分析基因转录测序数据与DNA甲基化修饰数据之间的相关性对于阐明食管癌的表观遗传调控机制具有重要意义。本研究通过从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库下载食管癌组织和癌旁组织中的m RNA和DNA甲基化数据,对差异表达基因和差异甲基化基因进行筛选和分析。然后对筛选的差异表达基因和差异甲基化基因进行验证并筛选出关键基因。再进一步分析筛选出的关键基因在食管癌中的表达情况,并探讨其与食管癌临床病理资料的关系。最后,通过敲低和过表达筛选出的关键基因来观察其对食管癌细胞株增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学行为的影响。本研究将有助于对食管癌的诊断、生物标志物的开发以及靶向治疗药物的研发提供理论基础。第一部分食管癌中差异表达基因和甲基化基因的筛选及分析目的:对食管癌组织和癌旁组织中差异表达基因和差异甲基化基因进行筛选,以期获得新的诊断和治疗靶标。方法:1.从TCGA数据库下载食管癌组织和癌旁组织的m RNA和DNA甲基化数据,通过R语言软件筛选出差异表达基因和差异甲基化基因。2.通过加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA)对下载的m RNA数据进行分析,确定最佳模块,并通过KEGG富集分析及GO分析研究最佳模块中基因的生物学功能。3.对差异表达基因和差异甲基化基因进行关联分析并确定关键基因。结果:1.我们共筛选出2408个差异表达基因,其中上调1311个,下调1097个。2.通过WGCNA对下载的m RNA数据进行共表达网络分析,共鉴定出49个模块,其中宝蓝色模块被确定为最佳模块。KEGG富集分析显示“胃酸分泌”和“蛋白质消化吸收”是仅有的两个显著富集的信号通路。GO富集分析显示“离子转运”和“跨膜转运”是显著富集的生物学过程,“细胞膜的组成成分”和“细胞膜”是显著富集的细胞成分,“电压门控离子通道活性”和“氯离子通道活性”是显著富集的分子功能。3.通过TCGA数据库共筛选出5134个差异甲基化位点,其中高甲基化位点4151个,低甲基化位点983个。差异甲基化位点对应1335个差异甲基化基因,其中高甲基化基因1098个,低甲基化基因237个。4.通过差异表达基因与差异甲基化基因关联分析发现宝蓝色模块中的核心基因ATP4A,ATP4B,CCKAR,MFSD4和ESRRG既是高甲基化基因,同时也是低表达基因。此外发现在这5个基因中,ESRRG基因与宝蓝色模块关系最密切,提示ESRRG可能在食管癌发生发展中起更重要的作用。小结:通过筛选共获得2408个差异表达基因和5134个差异甲基化位点。在WGCNA分析中,宝蓝色模块被认为是最佳模块。宝蓝色模块中的核心基因ATP4A,ATP4B,CCKAR,MFSD4和ESRRG既是高甲基化基因,同时也是低表达基因,表明上述5个基因可能在食管癌的发生发展中起重要作用。此外发现在这5个基因中,ESRRG基因与宝蓝色模块关系最密切,这表明ESRRG可能在食管癌发生发展中起更重要的作用。第二部分食管癌中差异表达基因和甲基化基因的验证及进一步分析目的:对筛选的差异表达基因和甲基化基因进行验证,并进一步找寻可能在食管癌发生发展中起重要作用的关键目的基因。方法:1.通过GEO数据库对筛选的ATP4A,ATP4B,CCKAR,MFSD4和ESRRG基因进行验证。2.通过TCGA数据库对ATP4A,ATP4B,CCKAR,MFSD4和ESRRG基因进行诊断分析。3.通过逆转录定量PCR(qRT-PCR)对食管癌组织和癌旁组织的ATP4A,ATP4B,CCKAR,MFSD4和ESRRG基因进行体外验证。4.通过与第一部分的关联分析,鉴定出在食管癌发生发展中起重要作用的关键目的基因。结果:1.GEO数据库分析结果显示,除CCKAR以外,ATP4A、ATP4B、MFSD4和ESRRG基因的表达水平在食管癌组织中均下调,其中ESRRG的下调水平最明显(P=3.2e-05)。结果表明在5个基因中,ESRRG可能在食管癌的发生发展中起更重要的作用。2.诊断分析结果显示,ATP4A、ATP4B、CCKAR、MFSD4和ESRRG的曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.605、0.645、0.805、0.761和0.747(大于0.7被认为诊断准确性较高)。结果表明CCKAR,MFSD4和ESRRG基因可能是诊断食管癌的潜在生物标志物。3.qRT-PCR验证结果显示ATP4A,ATP4B,CCKAR,MFSD4,ESRRG在食管癌组织中的表达均显著低于癌旁组织,差异具有统计学意义(均P<0.001),其中ESRRG的差异表达最明显。这些结果和生物信息学分析的结果一致。4.通过以上验证,并与第一部分关联分析,发现ESRRG基因可能是食管癌发生发展中起重要作用的关键目的基因。小结:我们通过多种生物信息学方法筛选食管癌差异表达关键基因的结果可靠。GEO数据库表达验证和qRT-PCR体外验证均显示ESRRG基因的表达水平在食管癌组织中下调最明显。诊断分析显示CCKAR,MFSD4和ESRRG基因可能是诊断食管癌的潜在生物标志物。通过与第一部分关联综合分析,我们发现ESRRG基因可能是食管癌发生发展中起重要作用的关键目的基因,可作为食管癌潜在诊断和治疗的新靶标。第三部分ESRRG在食管癌组织中的表达及临床相关性研究目的:探讨ESRRG在食管癌组织和癌旁组织中的表达水平,分析ESRRG的表达水平与临床病理特征之间的关系。方法:1.收集食管癌患者的临床标本,采集患者信息。2.通过qRT-PCR方法检测ESRRG在食管癌组织和癌旁组织中的表达。3.分析食管癌组织中ESRRG的表达水平与患者临床病理特征之间的关系。4.通过免疫组化检测食管癌组织和癌旁组织中ESRRG的表达。结果:1.qRT-PCR结果显示,与癌旁组织相比,食管癌组织中ESRRG的表达水平显著降低(P<0.0001)。2.ESRRG的表达水平与患者性别、年龄、饮酒、吸烟及肿瘤位置无相关性(均P﹥0.05),与淋巴结转移和TNM分期密切相关(均P<0.05)。ESRRG表达水平低的患者更容易出现淋巴结转移(χ~2=4.571,P<0.05),并且TNM分期更晚(χ~2=6.149,P<0.05)。3.免疫组化结果显示ESRRG在食管癌组织中的表达显著低于癌旁组织(P<0.0001)。小结:qRT-PCR显示ESRRG在食管癌组织中的表达显著低于癌旁组织。ESRRG的表达水平与患者性别、年龄、饮酒、吸烟及肿瘤位置无相关性,与淋巴结转移和TNM分期密切相关。免疫组化显示ESRRG在食管癌组织中的表达显著低于癌旁组织。以上结果表明ESRRG与食管癌的发生发展呈负相关。第四部分ESRRG对食管癌细胞株增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响目的:分别通过敲低和过表达ESRRG基因在食管癌细胞株中的表达,分析ESRRG基因对食管癌细胞株增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法:针对ESRRG在食管癌细胞株中的表达情况,在KYSE510细胞株中转染ASO-NC、ASO-ESRRG,以敲低ESRRG;在TE-1细胞株中转染pc DNA3.1、pc DNA3.1/ESRRG,以过表达ESRRG。然后检测各组细胞中ESRRG m RNA表达水平。再通过MTT、细胞划痕、Transwell实验和流式细胞术检测ESRRG对食管癌细胞株增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。结果:1.qRT-PCR结果显示:在KYSE510细胞株中,敲低ESRRG的ASO-ESRRG组与ASO-NC组相比,ASO-ESRRG组的ESRRG m RNA表达明显降低,两组相比具有显著性差异(P<0.001)。在TE-1细胞株中,过表达ESRRG的pc DNA3.1/ESRRG组与pc DNA3.1相比,pc DNA3.1/ESRRG组的ESRRG m RNA表达明显增加,两组相比具有显著性差异(P<0.001)。2.MTT显示,在KYSE510细胞株中,敲低ESRRG的ASO-ESRRG细胞组与ASO-NC细胞组相比,ASO-ESRRG组在24 h、48 h、72 h增殖能力更强,两组相比具有显著性差异(P<0.05)。在TE-1细胞株中,过表达ESRRG的pc DNA3.1/ESRRG细胞组与pc DNA3.1细胞组相比,pc DNA3.1/ESRRG组在24 h、48 h、72 h细胞株增殖能力明显降低,两组相比具有显著性差异(P<0.05)。3.细胞划痕实验显示,在KYSE510细胞株中,敲低ESRRG的ASO-ESRRG组的迁移距离明显高于ASO-NC组,两组相比具有显著性差异(P<0.01)。在TE-1细胞株中,过表达ESRRG的pc DNA3.1/ESRRG组的迁移距离明显低于pc DNA3.1组,两组相比具有显著性差异(P<0.01)。4.Transwell细胞侵袭实验显示,在KYSE510细胞株中,敲低ESRRG的ASO-ESRRG组的侵袭细胞数明显高于ASO-NC组,两组相比具有显著性差异(P<0.01)。在TE-1细胞株中,过表达ESRRG的pc DNA3.1/ESRRG组的侵袭细胞数明显低于pc DNA3.1组,两组相比具有显著性差异(P<0.01)。5.流式细胞检测显示,在KYSE510细胞株中,敲低ESRRG的ASO-ESRRG组的凋亡率明显低于ASO-NC组,两组相比具有显著性差异(P<0.05)。在TE-1细胞株中,过表达ESRRG的pc DNA3.1/ESRRG组的凋亡率明显高于pc DNA3.1组,两组相比具有显著性差异(P<0.05)。小结:敲低食管癌KYSE510细胞株中的ESRRG,KYSE510细胞的增殖能力明显增强,迁移及侵袭能力明显增强,细胞凋亡比例明显降低。过表达食管癌TE-1细胞株中的ESRRG,TE-1细胞的增殖能力明显降低,迁移及侵袭能力明显降低,细胞凋亡比例明显上升。以上结果表明ESRRG能抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡。这说明ESRRG基因有望成为治疗食管癌的新靶标。
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