论文部分内容阅读
背景和目的骨性关节炎是老年人疼痛和致残的常见原因,随着人口老龄化和人们生活水平的提高其发病率逐步上升,其根本原因在于肥胖、不适当的机械应力、炎症递质和生化因子的共同作用。早期骨性关节炎的治疗方法包括口服药物、关节腔内注药、还可以通过微创手术进行自体软骨细胞移植、骨软骨同种异体骨植入、关节镜下微骨折技术处理等。目前研究表明,一段时间内的疗效尚可,随着时间的推移发现其解决软骨退化、再生及修复等多方面的疗效有限,最终仍需要通过关节置换来解决。然而,手术给患者带来了较大经济负担和较多的精神心理压力,因此早期药物治疗来解决骨性关节炎的退变仍具有重要的临床意义。姜黄素是从姜科植物的根茎中提取的,主要成分为二十二烷基甲烷,已被证明具有抗氧化、减轻炎症、抗菌、抗肿瘤、神经保护、心脏保护、辐射防护以及抑制关节退变的作用。镁作为生命必须的元素之一,在人体中起着不可或缺的作用。硫酸镁(MgSO4)在临床医学中常用作治疗痉挛、先兆子痫等疾病,同时其还可以缓解关节疼痛,抑制关节退变的作用。目前尚缺乏关于姜黄素和硫酸镁联合应用对炎性软骨细胞作用及其机制的相关研究。本研究将收集临床中骨性关节炎病人的炎性软骨,进行分离和原代培养。通过免疫荧光染色、定量PCR检测炎性软骨细胞蛋白及基因水平表达量。行体外3D培养软骨分化特异性染色和TUNEL细胞凋亡染色,检测炎性软骨逆分化程度。从而探讨姜黄素和MgS04联合应用对炎性软骨细胞逆分化的作用及其相关机制。为临床早期治疗炎性软骨细胞的退变,提供新的药物治疗思路和方法。方法1.原代炎性软骨细胞的分离和培养,MTS细胞增殖实验检测原代炎性软骨细胞在单层细胞培养条件下第2、3代细胞增殖情况。2.将实验细胞分为4组,炎性软骨细胞单独培养为炎性软骨细胞组,姜黄素干预培养为姜黄素组,MgSO4干预培养为MgSO4组,姜黄素+MgSO4联合干预培养为联合培养组。3.细胞爬片、免疫荧光染色以及QPCR定量检测单层细胞培养下,4组细胞成软骨标志物蛋白及基因水平表达量。4.行体外3D诱导分化培养4组细胞18 d,收获4组细胞团块。测量各组细胞团块大小后行石蜡包埋切片、阿尔新蓝、番红O染色以及TUNEL细胞凋亡检测(显色法)各组细胞团块软骨分化阳性区域面积以及细胞凋亡阳性区域面积。5.所有试验重复3次以上,数据结果以x+s表示,用SPSS 22.0软件进行数据处理及统计学分析,组间数据比较应用单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.MTS细胞增殖实验结果显示,第2代炎性软骨细胞早期增殖速率较高,分化程度较低。2.细胞爬片、免疫荧光染色结果显示联合培养组、姜黄素组以及MgSO4组在成软骨分化标志物Ⅱ型胶原蛋白水平表达量均高于炎性软骨细胞组(P<0.01)。3.QPCR定量检测结果显示联合培养组在Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖和SOX9 mRNA表达量均高于姜黄素组或MgSO4组(P<0.05)。在基因SOX9的表达量上MgS04组好于姜黄素组(P<0.01)。4.行体外3D诱导分化培养4组细胞18d后,联合培养组细胞团块大小、软骨逆分化阿尔新蓝、番红O染色阳性区域均明显高于其他3组(P<0.01)。TUNEL细胞凋亡染色实验结果显示,联合培养组及MgSO4组阳性区域面积均明显小于另外2组(P<0.01)。结论联合应用姜黄素和MgS04促进炎性软骨细胞的逆分化具有协同作用,可能是姜黄素通过诱导炎性软骨细胞向正常软骨细胞分化和MgSO4诱导炎性软骨细胞SOX9基因上调,以及抑制炎性软骨细胞凋亡的作用来实现。