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研究背景:脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是以造成患者损伤平面以下所支配区域感觉、运动功能及排尿、排便功能异常为主要临床表现的一种高发性、难治性中枢神经系统损伤。随着社会经济和交通运输业的发展,SCI的发生率呈逐年增高趋势,严重影响患者生活质量,由此也给患者、家人、国家带来了严重的社会经济负担。目前对于SCI的研究虽然取得了一些可喜成果,但是在实际的临床工作中,SCI的治疗效果仍不理想,SCI的治疗仍是医学界一个有待攻克的难题。可见,开展SCI的治疗研究是一个急迫且具有科学和社会意义的课题。SCI是一个长期的复杂的损伤过程:既包括受伤当时的直接机械暴力本身对神经细胞、神经胶质细胞、血管等的离断、破坏所引起的原发性损伤,又包括损伤后一段时间内的炎症反应、组织水肿、组织缺氧、组织缺血、脂质过氧化作用、谷氨酸受体过度激活、钙离子超载通路激活等一系列因素导致的继发性级联损伤。SCI在直接导致神经细胞死亡的同时,还可引起少突胶质细胞大量死亡,进而导致轴突脱髓鞘改变,严重影响机体各种神经功能的发挥。少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Precursor Cells,OPCs)是少突胶质细胞系发育的起始细胞,是还未成熟的少突胶质细胞。一方面,OPCs具较强的增殖能力,能够在体内快速增殖;另一方面,OPCs能在特定信号因子的作用下定向迁移,最终分化为成熟少突胶质细胞,包绕轴突形成髓鞘。已有相关研究结果表明:通过OPCs细胞移植,OPCs能够在体内存活,促进髓鞘形成,最终明显改善SCI大鼠的运动、神经功能。趋化因子除了早期发现的对炎症细胞、骨髓细胞起传统的趋化作用外,现在还发现在胚胎期中枢神经系统的发育,神经损伤后的修复过程中均具有不同程度的作用。在正常生理条件下,中枢神经系统广泛表达CXCL12/CXCR4,起着介导神经元前体细胞向最终功能区域定向迁移的作用。在病理条件下,CXCL12/CXCR4分子更是与神经系统损伤、修复过程密切相关。已有文献报道:CXCL12对脉络膜视网膜血管内皮细胞、肿瘤细胞、神经胶质瘤细胞及其前体细胞、初级小胶质细胞、神经前体细胞等多种细胞增殖、分化等生长均具有一定影响。也有发现CXCL12可以通过影响基质金属蛋白酶3(Matrix Metalloproteinase3,MMP3)and基质金属蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase9,MMP9)的表达变化来影响神经前体细胞的增殖和分化。因此,我们有理由推测CXCL12也有可能以类似的作用机制参与由神经前体细胞分化而来的OPCs增殖、分化过程的调控。因此,本实验拟行OPCs的分离纯化,建立其体外培养模型,观察其在体外生长、增殖情况。探索CXCL12对OPCs增殖的影响,并检测CXCR4、CXCR7、MMP9在其中的重要作用,以期更好的了解OPCs增殖、分化特性,为后期研究移植后的OPCs在体内存活、增殖、分化调节,脱髓鞘轴突的再髓鞘化,轴突的再生,最终为脊髓损伤的治疗奠定一定的实验基础。方法:1.选用出生48小时(hour,h)内的SD大鼠,取大脑皮质组织,用振荡分离、差速贴壁等方法分离、纯化、培养获得OPCs。采用免疫细胞化学技术,根据早期OPCs细胞膜上特异性的表达PDGFR-α,行分离获得的OPCs鉴定。将OPCs转入定向分化培养基中继续培养一定时间后,根据OPCs诱导中晚期O4、MBP表达,行少突胶质细胞成熟情况的鉴定。2.体外条件下,用CCK-8法检测OPCs在不同浓度的CXCL12(0ng/m L、5ng/m L、10ng/m L、20ng/m L)培养条件下,在不同时间点(0h、24h、48h、72h)的增殖情况。利用Western blot法检测OPCs在不同浓度的CXCL12作用72h后下游CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达。3.在20ng/m L的CXCL12培养条件下,选用经过筛选后能够有效干扰OPCs的CXCR4、CXCR7表达的CXCR4 si RNA、CXCR7 si RNA分别干扰CXCR4、CXCR7蛋白表达。用CCK-8检测各实验组(CXCL12、CXCL12+con si RNA、CXCL12+CXCR4si RNA、CXCL12+CXCR7 si RNA)OPCs在不同时间点(0h、24h、48h、72h)的增殖情况,用Western blot法检测OPCs各实验组条件下作用72h后CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达情况。4.利用经过筛选后能够有效干扰CXCR4、CXCR7下游的MMP9表达的MMP9si RNA干扰MMP9表达,然后CCK-8检测在20ng/m L的CXCL12条件下OPCs在各时间点(0h、24h、48h、72h)的增殖情况。结果:1.在原代培养第9-10天,细胞呈明显分层生长态势,利用振荡分离、差速贴壁方法获得了大量高纯度的OPCs。刚开始细胞胞体较小,直径6~10μm,近似的呈圆形,为折光性较强的小亮点,有的胞体开始有细小的两极细胞突起或者三极细胞突起出现。免疫细胞化学检测结果显示:分离后OPCs能特异性表达PDGFR-α,定向分化培养后,OPCs趋于成熟,周围纤细突起较未诱导前稍增多,细胞胞体增大,诱导中期O4表达呈阳性,诱导晚期胞体网状纤细突起更加明显,呈“树枝状”甚至“蜘蛛网状”分布,MBP表达呈阳性,是成熟的髓鞘形成细胞。2.在一定浓度范围内,随着培养基中CXCL12浓度增加,OPCs增殖作用逐渐增强,CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达量逐渐增加;在一定范围的培养时间内,随着培养时间的延长,OPCs增殖逐渐增强,CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白的表达量逐渐增加。与0ng/m L相比,20ng/m LCXCL12作用72h后,OPCs增殖及CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达增加最明显(P<0.05)。3.用CXCR4 si RNA、CXCR7 si RNA分别干扰CXCR4、CXCR7蛋白表达后,OPCs在各时间点的增殖均逐渐受到抑制,培养72h后差异最显著(P<0.05、P<0.05),CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达量逐渐减少,培养72h后差异最显著(P<0.05、P<0.01)。4.单独用MMP9 si RNA干扰MMP9表达后,OPCs增殖同样受到抑制,增殖作用降低(P<0.05)。结论1.本实验通过振荡分离、差速贴壁法分离获得了实验所需的原代OPCs,在体外培养条件下可以继续存活,分化成熟。2.在一定的浓度和时间范围内,CXCL12能够明显促进OPCs的增殖,这种促增殖作用与CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达上调密切相关。