论文部分内容阅读
目的固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)裂解激活蛋白(SCAP)是内质网上的一个膜蛋白,能够感受细胞内胆固醇浓度的变化,影响下游胆固醇合成和摄入,通过Insig-SCAP-SREBPs-LDLr/HMG-CoA还原酶通路来实现对细胞内脂质稳态平衡的调节。过去的研究中我们已经证实炎症因子可以干扰胆固醇敏感器SCAP的正常功能,即在高浓度胆固醇状态下,仍然携带LDL受体的转录因子SREBP从内质网逃逸到高尔基体激活,导致细胞大量摄取LDL胆固醇并形成泡沫细胞。本研究在我们过去研究的基础上,我们选用HMCs细胞系(1)探讨在炎症状态下,是否引起SCAP表达增加,从而引起LDLr及HMGcoA reductase的表达增加,并且由于反馈失调导致细胞内胆固醇异常聚集和泡沫细胞形成；(2)在超表达SCAP状态下,观察是否引起细胞内LDLr和HMGCoA还原酶(HMGCoA reductase)表达增加,并且因反馈失调导致胆固醇细胞内异常聚集而致泡沫细胞形成,同时超表达SCAP能否协同炎症状态下胆固醇的异常摄取和合成。(3)进一步观察SCAP基因沉默状态下是否引起细胞内LDLr和HMGCoA还原酶(HMGCoA reductase)表.达下调,同时拮抗炎症状态下的SCAP功能失调,从而减少炎症状态下胆固醇的异常摄取和合成。探索动脉粥样硬化疾病治疗潜在的新靶点。材料和方法用分子克隆技术对超表达质粒的酶切鉴定、小量和大量制备SCAP超表达质粒；用氯化铯密度梯度超速离心纯化DNA；用电穿孔技术,转染超表达SCAP的质粒,同时转染带有绿色荧光的对照质粒,用流式细胞仪检测转染效率；用电转染的方法转染特异的SCAP siRNA,从而干扰SCAP的基因表达,同时设立RNA干扰的阴性和阳性对照。用酶学方法检测HMCs细胞内总胆固醇(TC),游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)的水平；油红0染色观察细胞内脂质积聚情况；提取细胞总RNA,应用real-time定量PCR技术分别检测细胞的SCAP、LDLr、 HMGCoA还原酶水平；用Western bloting检测nSREBP2, LDLr, HMGCoA还原酶和PCSK9蛋白表达水平。结果1.炎症因子IL-1p或LPS能促进肾系膜细胞SCAP的表达,从而增加下游LDLr及HMGCoA还原酶mRNA.蛋白水平,促进细胞胆固醇的外源性摄入和内源性合成,导致胆固醇在细胞内异常聚集。同时炎症因子可以打破细胞胆固醇水平升高所致的反馈抑制调节,使胞内胆固醇异常聚集。2.在SCAP超表达状态下,有类似炎症因子作用引起细胞内LDLr和HMGCoA还原酶(HMGCoA reductase)表达增加,从而增加细胞胆固醇的外源性摄入和内源性合成；同时超表达SCAP可以打破胞内胆固醇水平升高所致的反馈抑制调节,从而使胞内胆固醇异常聚集,促进泡沫细胞形成；并且超表达SCAP可以协同炎症引起的细胞内LDLr和HMGCoA还原酶(HMGCoA reductase)表达增加,增加炎症状态下胆固醇的异常聚集。3. SCAP基因沉默状态下,引起细胞内LDLr和HMGCoA还原酶(HMGCoA reductase)表达下降,更重要的是能拮抗炎症因子的作用,使炎症状态下细胞内LDLr和HMGCoA还原酶(HMGCoA reductase)表达降低,减少炎症状态下的胆固醇异常聚集。