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作为我国东北地区传统道地药用植物，短梗五加和刺五加的叶片中最主要的有效成分，一种3,4-裂环羽扇豆烷型三萜皂苷——chiisanoside已被课题组证明具有广泛的药理活性，例如抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗急性肝损伤等。而对于其次级苷，相关报道则极少。此外，考虑到因二者较近的亲缘关系、近乎相同的生长环境造成的短梗五加叶和刺五加叶在活性成分方面相近，而刺五加叶作为黑龙江省地方中药材用于心脑血管疾病的治疗，课题组前期研究发现短梗五加叶总三萜皂苷有效部位亦具有一定的抗心律失常作用。本文从短梗五加叶的总三萜皂苷中分离出了主要成分chiisanoside及其两种微量次级苷以及苷元，通过半合成工艺以chiisanoside为原料实现了稀有微量次级苷及苷元的制备；并通过多种动物模型以及细胞实验，对这些有效成分的抗心律失常活性、作用机理以及初步构效关系进行了研究；并进一步对刺五加叶和短梗五加叶的采收期和产地加工方式进行了研究。主要内容及结果如下：
1、短梗五加叶Chiisanoside次级苷(元)的分离与制备
首先利用硅胶柱色谱法对短梗五加叶的总三萜皂苷有效部位进行分离，得到了4种3,4-裂环羽扇豆烷型三萜皂苷(元)，包括3种已知皂苷(元)chiisanoside(CSS)、divaroside(DVS)、chiisanogenin(CSG)，以及一种稀有微量的三萜皂苷sessiloside-A1(SSA)，通过波谱法及理化性质鉴定上述化合物的结构，其中SSA为未见报道的新天然产物。同时建立了以短梗五加叶总三萜皂苷有效部位及主要有效成分CSS为原料，利用鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶定向生产微量稀有皂苷DVS、SSA的适合工业化生产的工艺，实现了这些稀有皂苷的大量制备，为其后续药理活性研究及开发提供了基础。
2、短梗五加叶3,4-裂环羽扇豆烷型三萜皂苷(元)的抗心律失常研究
建立了三种不同的室性心律失常模型，包括氯化钡(BaCl2)模型、乌头碱模型以及氯仿模型，来探索短梗五加叶4种3,4-裂环羽扇豆烷型三萜皂苷(元)抗心律失常活性、作用机制及初步构效关系。
(1)BaCl2所致大鼠室性心律失常模型。雄性Wistar大鼠，随机分为6组，每组6只，通过前期的剂量筛选，确定了给药剂量，4种受试药均为0.05mmol/kg(CSS：47.8 mg/kg， DVS：40.4mg/kg，SSA：32.3mg/kg，CSG：24.2mg/kg)，给药方式为腹腔注射，给药30min后，从尾静脉注射4mg/kg的BaCl2诱发心律失常，并监测30min内大鼠心电图的变化。观测结束后分离大鼠血清以及左心室组织，酶联免疫法检测相关指标。结果表明：在30min的有效观察期内，DVS预处理能完全缓解由BaCl2诱导的室性心律失常，造模前后心电图无明显变化。CSG预处理能明显缩短BaCl2诱发的室性早搏(VP)和室性心动过速(VT)。生化指标测定结果显示，相对模型组，这4种三萜类化合物均能增加血清SOD含量，并降低血清MDA含量，提高心室Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+?ATP酶的含量。在此模型中，这四种三萜类化合物表现优劣顺序为DVS＞CSG＞SSA≈CSS，连接两个葡萄糖或者没有糖的表现较好，其构效关系可能与苷元上连接的糖有关。综上所述，DVS和CSG对BaCl2诱发的室性心律失常有明显的防护作用。
(2)乌头碱所致大鼠室性心律失常模型。实验动物预处理、分组、给药剂量同BaCl2模型。从尾静脉快速注射20μg/kg的乌头碱诱发心律失常，监测90min内大鼠心电图的变化。观测结束后取大鼠血清以及左心室组织，酶联免疫法检测相关指标，并利用HE染色及Westernblot技术，分析这4种三萜类化合物对乌头碱所致心律失常的作用、作用机制及构效关系。结果表明：在90min的心电图观察期内，相对模型组，DVS组能够显著缩短心律失常持续时间，CSS、DVS、SSA能够显著延缓心律失常出现的时间并且减少VT持续时间。生化指标测定结果显示，与模型组相比，这4种三萜类化合物均可增加血清SOD含量，降低血清MDA水平；CSS、DVS、SSA能够显著的提升心室Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+?ATP酶的含量。在此模型中，这四种三萜类化合物表现优劣顺序为DVS＞CSS＞CSG≈SSA，其构效关系可能与C-28位上连接的糖的类别有关。综上所述，DVS具有优秀的抗心律失常活性，其作用机制可能与其抗氧化相关。
(3)氯仿所致小鼠室性心律失常模型。SPF级雄性ICR小鼠60只，随机分为6组，预处理同BaCl2模型，给药剂量按等效剂量系数折算法换算。采用氯仿吸入法诱导小鼠发生心律失常，监测300s内小鼠心电图变化，记录小鼠的室颤发生率以及死亡率。结果显示：与模型组室颤发生率(100%)相比，各给药组室颤发生率均有所降低；与模型组死亡率(100%)比较，各给药组死亡率均降低。这四种三萜类化合物能够降低氯仿所致的室颤发生率以及死亡率，明显增加小鼠的存活时间，显著性延长心律失常潜伏时间，提示了他们具有一定的抗氯仿所致小鼠心律失常活性，其中DVS表现最佳。
3、短梗五加叶3,4-裂环羽扇豆烷型三萜皂苷(元)减缓乌头碱所致H9C2细胞损伤活性研究
使用H9C2细胞进行体外实验研究。首先使用CCK-8法确定了乌头碱的毒性剂量，并检测了短梗五加叶4种3,4-裂环羽扇豆烷型三萜皂苷(元)对细胞活力的影响。进一步优选以DVS为研究对象，考察DVS对乌头碱所致H9C2细胞损伤的影响。设定DVS三个给药剂量(10、25、50μM)，每组6个重复。首先使用含DVS培养基培养细胞，2h后更换为含乌头碱(50μM)培养基进行培养。使用LDH和CK-MB试剂盒分析细胞的损伤程度，流式细胞仪分析线粒体膜电位变化以及细胞内ROS的生成，hoechst染色技术检测细胞核凋亡水平，流式细胞仪和激光共聚焦观察细胞内Ca2+离子浓度变化。结果表明：相对模型组，DVS显著降低了细胞外LDH和CK-MB的水平，并减少线粒体膜电位的变化以及ROS的生成，同时减少了细胞的凋亡。Ca2+离子浓度变化分析表明，DVS可以调节细胞内外的离子平衡，达到维持细胞稳定状态的作用。综上所述，DVS减缓乌头碱所致细胞活力的损伤可能与其调节细胞内Ca2+离子浓度以及抗氧化，抗凋亡有关。
4、HPLC法测定不同采收期短梗五加叶和刺五加叶中金丝桃苷、CSS和CSG含量变化
定点定期采集短梗五加叶和刺五加叶样品，立即采用自然阴干以及杀青两种处理方式处理鲜叶样品，利用HPLC法对不同采收期的不同处理方式的样品中的金丝桃苷、CSS和CSG的含量进行测试，以期为短梗五加叶和刺五加叶采收期和产地加工方式的确定提供科学依据。测试结果显示定点定期采集短梗五加叶和刺五加叶样品，立即采用自然阴干以及杀青两种处理方式处理鲜叶样品，利用HPLC法对不同采收期的不同处理方式的样品中的金丝桃苷、CSS和CSG的含量进行测试，以期为短梗五加叶和刺五加叶采收期和产地加工方式的确定提供科学依据。测试结果显示：短梗五加叶中CSS的含量远远高于刺五加，而刺五加叶中金丝桃苷的含量则远远大于短梗五加；自然阴干的短梗五加叶九月中旬才会出现CSG，而杀青的叶片内含量极低；刺五加叶内未检测到CSS，这是刺五加叶与短梗五加叶在成份上的重要区别。在刺五加叶中，金丝桃苷含量在六月中旬到达峰值之后开始缓慢下降；CSS的含量在五月和九月含量较低，在其他时间内相对较高；CSG则无。在短梗五加叶中，金丝桃苷在六月中旬以及八月中旬有两个峰值，其他时间含量较低；CSS的含量整体呈缓慢下降趋势，九月中旬后迅速下降，同时CSG含量迅速上升。综合所述，短梗五加叶更适合作为CSS的来源，采收期推荐夏季，以及秋季并对叶子进行杀青处理。
1、短梗五加叶Chiisanoside次级苷(元)的分离与制备
首先利用硅胶柱色谱法对短梗五加叶的总三萜皂苷有效部位进行分离，得到了4种3,4-裂环羽扇豆烷型三萜皂苷(元)，包括3种已知皂苷(元)chiisanoside(CSS)、divaroside(DVS)、chiisanogenin(CSG)，以及一种稀有微量的三萜皂苷sessiloside-A1(SSA)，通过波谱法及理化性质鉴定上述化合物的结构，其中SSA为未见报道的新天然产物。同时建立了以短梗五加叶总三萜皂苷有效部位及主要有效成分CSS为原料，利用鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶定向生产微量稀有皂苷DVS、SSA的适合工业化生产的工艺，实现了这些稀有皂苷的大量制备，为其后续药理活性研究及开发提供了基础。
2、短梗五加叶3,4-裂环羽扇豆烷型三萜皂苷(元)的抗心律失常研究
建立了三种不同的室性心律失常模型，包括氯化钡(BaCl2)模型、乌头碱模型以及氯仿模型，来探索短梗五加叶4种3,4-裂环羽扇豆烷型三萜皂苷(元)抗心律失常活性、作用机制及初步构效关系。
(1)BaCl2所致大鼠室性心律失常模型。雄性Wistar大鼠，随机分为6组，每组6只，通过前期的剂量筛选，确定了给药剂量，4种受试药均为0.05mmol/kg(CSS：47.8 mg/kg， DVS：40.4mg/kg，SSA：32.3mg/kg，CSG：24.2mg/kg)，给药方式为腹腔注射，给药30min后，从尾静脉注射4mg/kg的BaCl2诱发心律失常，并监测30min内大鼠心电图的变化。观测结束后分离大鼠血清以及左心室组织，酶联免疫法检测相关指标。结果表明：在30min的有效观察期内，DVS预处理能完全缓解由BaCl2诱导的室性心律失常，造模前后心电图无明显变化。CSG预处理能明显缩短BaCl2诱发的室性早搏(VP)和室性心动过速(VT)。生化指标测定结果显示，相对模型组，这4种三萜类化合物均能增加血清SOD含量，并降低血清MDA含量，提高心室Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+?ATP酶的含量。在此模型中，这四种三萜类化合物表现优劣顺序为DVS＞CSG＞SSA≈CSS，连接两个葡萄糖或者没有糖的表现较好，其构效关系可能与苷元上连接的糖有关。综上所述，DVS和CSG对BaCl2诱发的室性心律失常有明显的防护作用。
(2)乌头碱所致大鼠室性心律失常模型。实验动物预处理、分组、给药剂量同BaCl2模型。从尾静脉快速注射20μg/kg的乌头碱诱发心律失常，监测90min内大鼠心电图的变化。观测结束后取大鼠血清以及左心室组织，酶联免疫法检测相关指标，并利用HE染色及Westernblot技术，分析这4种三萜类化合物对乌头碱所致心律失常的作用、作用机制及构效关系。结果表明：在90min的心电图观察期内，相对模型组，DVS组能够显著缩短心律失常持续时间，CSS、DVS、SSA能够显著延缓心律失常出现的时间并且减少VT持续时间。生化指标测定结果显示，与模型组相比，这4种三萜类化合物均可增加血清SOD含量，降低血清MDA水平；CSS、DVS、SSA能够显著的提升心室Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+?ATP酶的含量。在此模型中，这四种三萜类化合物表现优劣顺序为DVS＞CSS＞CSG≈SSA，其构效关系可能与C-28位上连接的糖的类别有关。综上所述，DVS具有优秀的抗心律失常活性，其作用机制可能与其抗氧化相关。
(3)氯仿所致小鼠室性心律失常模型。SPF级雄性ICR小鼠60只，随机分为6组，预处理同BaCl2模型，给药剂量按等效剂量系数折算法换算。采用氯仿吸入法诱导小鼠发生心律失常，监测300s内小鼠心电图变化，记录小鼠的室颤发生率以及死亡率。结果显示：与模型组室颤发生率(100%)相比，各给药组室颤发生率均有所降低；与模型组死亡率(100%)比较，各给药组死亡率均降低。这四种三萜类化合物能够降低氯仿所致的室颤发生率以及死亡率，明显增加小鼠的存活时间，显著性延长心律失常潜伏时间，提示了他们具有一定的抗氯仿所致小鼠心律失常活性，其中DVS表现最佳。
3、短梗五加叶3,4-裂环羽扇豆烷型三萜皂苷(元)减缓乌头碱所致H9C2细胞损伤活性研究
使用H9C2细胞进行体外实验研究。首先使用CCK-8法确定了乌头碱的毒性剂量，并检测了短梗五加叶4种3,4-裂环羽扇豆烷型三萜皂苷(元)对细胞活力的影响。进一步优选以DVS为研究对象，考察DVS对乌头碱所致H9C2细胞损伤的影响。设定DVS三个给药剂量(10、25、50μM)，每组6个重复。首先使用含DVS培养基培养细胞，2h后更换为含乌头碱(50μM)培养基进行培养。使用LDH和CK-MB试剂盒分析细胞的损伤程度，流式细胞仪分析线粒体膜电位变化以及细胞内ROS的生成，hoechst染色技术检测细胞核凋亡水平，流式细胞仪和激光共聚焦观察细胞内Ca2+离子浓度变化。结果表明：相对模型组，DVS显著降低了细胞外LDH和CK-MB的水平，并减少线粒体膜电位的变化以及ROS的生成，同时减少了细胞的凋亡。Ca2+离子浓度变化分析表明，DVS可以调节细胞内外的离子平衡，达到维持细胞稳定状态的作用。综上所述，DVS减缓乌头碱所致细胞活力的损伤可能与其调节细胞内Ca2+离子浓度以及抗氧化，抗凋亡有关。
4、HPLC法测定不同采收期短梗五加叶和刺五加叶中金丝桃苷、CSS和CSG含量变化
定点定期采集短梗五加叶和刺五加叶样品，立即采用自然阴干以及杀青两种处理方式处理鲜叶样品，利用HPLC法对不同采收期的不同处理方式的样品中的金丝桃苷、CSS和CSG的含量进行测试，以期为短梗五加叶和刺五加叶采收期和产地加工方式的确定提供科学依据。测试结果显示定点定期采集短梗五加叶和刺五加叶样品，立即采用自然阴干以及杀青两种处理方式处理鲜叶样品，利用HPLC法对不同采收期的不同处理方式的样品中的金丝桃苷、CSS和CSG的含量进行测试，以期为短梗五加叶和刺五加叶采收期和产地加工方式的确定提供科学依据。测试结果显示：短梗五加叶中CSS的含量远远高于刺五加，而刺五加叶中金丝桃苷的含量则远远大于短梗五加；自然阴干的短梗五加叶九月中旬才会出现CSG，而杀青的叶片内含量极低；刺五加叶内未检测到CSS，这是刺五加叶与短梗五加叶在成份上的重要区别。在刺五加叶中，金丝桃苷含量在六月中旬到达峰值之后开始缓慢下降；CSS的含量在五月和九月含量较低，在其他时间内相对较高；CSG则无。在短梗五加叶中，金丝桃苷在六月中旬以及八月中旬有两个峰值，其他时间含量较低；CSS的含量整体呈缓慢下降趋势，九月中旬后迅速下降，同时CSG含量迅速上升。综合所述，短梗五加叶更适合作为CSS的来源，采收期推荐夏季，以及秋季并对叶子进行杀青处理。