关节软骨在关节负重和运动中起着十分重要的作用,同时它也是关节内骨折中最易损伤的结构。成熟的软骨细胞特别是透明软骨细胞再生能力较弱,一旦软骨细胞受到破坏将加速软骨细胞凋亡的发生,形成局部软骨缺损,易出现骨性关节炎,引发疼痛、关节畸形及残疾,严重影响患者的健康和生活。目前临床上采用了多种方法治疗软骨缺损,但治疗效果尤其是长期效果不稳定。近年来,组织工程技术的发展,为解决软骨损伤的修复这一难题提供了可能性,来源于各种组织的间充质干细胞被用于组织工程修复的种子细胞,其中脂肪来源的间充质干细胞(ADSCs)因其来源广泛、在机体内性能和含量稳定、对机体损伤很小、培养条件较简单、增殖能力较强等特点,日益受到学者们的关注。干细胞被证实可向机体受损部位迁移,这种迁移活动与多种趋化因子密切相关。基质细胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1, SDF-1)是由骨髓基质细胞及其它相关的间皮细胞和上皮细胞分泌的一种趋化蛋白,是已知的干细胞迁移的主要趋化因子,在干细胞的动员和归巢起了关键性的作用。SDF-1的生物学功能复杂,广泛参与细胞发育、调控干细胞的迁移并与恶性肿瘤的生长转移密切相关。最近的研究显示,与SDF-1野生型小鼠相比,SDF-1-/-小鼠胚胎的肱骨长度明显短缩,组织学分析表明,SDF-1在肥大前期和肥大期的软骨细胞内均有表达,说明SDF-1在调控软骨细胞分化成熟过程中也扮演着十分重要的作用。我们认为,SDF-1的上述对干细胞诱导趋化及对软骨细胞分化调控的作用使得其在软骨缺损再生修复中可能存在有广阔的应用空间,因此,我们设计了此项研究。本课题拟将SDF-1整合至PLGA支架中,使其在体内局部释放,然后复合脂肪来源的干细胞修复软骨缺损,SDF-1可以使移植和体内来源的干细胞迁移至缺损部位,从而促进软骨再生,同时采用荧光标记示踪移植的ADSCs.实验分为三部分：(1)兔ADSCs的培养、鉴定及SDF-1对ADSCs的增殖、分化作用；(2)双层PLGA支架制作及SDF-1/PLGA支架对ADSCs增殖、分化的影响；(3)载有ADSCs的SDF-1/PLGA复合体修复兔关节软骨缺损的研究。第一部分兔ADSCs的培养、鉴定及SDF-1对ADSCs的增殖、分化作用目的：观察SDF-1在2D下对ADSCs增殖、分化的作用,寻找一种最优的SDF-1浓度。方法：取成年新西兰兔颈部皮下脂肪,用酶消化、梯度离心、贴壁培养法对兔ADSCs进行分离、培养并鉴定。取第三代ADSCs,用含不同浓度的SDF-1(0μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L、200μg/L)培养基进行培养,MTT方法检测细胞增殖,RT-PCR方法检测ADSCs的CXCR4表达情况,同时采用Transwell方法检测ADSCs在不同浓度SDF-1作用下的迁移作用。结果：阳性标志物CD105, CD73, CD90, CD166, CD29, CD44在ADSCs中均有强阳性>90%的阳性表达,而且ADSCs可以向骨、软骨、脂肪方向三系分化。SDF-1能促进ADSCs增殖、CXCR4的基因表达及ADSCs的迁移,而且具有浓度依赖性,随着浓度升高,作用增强。与同等浓度SDF-1组相比,经anti-CXCR4处理后ADSCs增殖、CXCR4表达及迁移均降低,仍高于正常对照组。结论：SDF-1可以促进ADSCs增殖和迁移,并且随着浓度升高,其作用增强；SDF-1可能通过上调CXCR4的表达并与之结合在促进ADSCs的体外增殖和迁移中起关键作用；SDF-1促进ADSCs的增殖和迁移作用中可能存在的信号分子机制仍需进一步的研究。第二部分双层PLGA支架制作及SDF-1/PLGA支架对ADSCs增殖、分化的影响目的：观察SDF-1从PLGA支架中的释放效率及在3D环境下SDF-1对ADSCs增殖、分化的影响。方法：用明胶颗粒作为致孔剂,利用致孔剂浸出技术制作双层PLGA支架。将SDF-1溶液(100ng/ml)30μl加入到]PLGA支架上,利用ellisa试剂盒检测不同时间点SDF-1释放情况,计算其累积释放效率；同时将ADSCs种植于支架上,研究在3D环境下,缓释的SDF-1对ADSCs的增殖及CXCR4基因的表达情况。结果：我们制作的PLGA支架具有致密层和疏松层,即具有大、小两层微孔,大孔直径在400μm和小孔直径150μm左右。ADSCs在支架大孔壁上铺展良好,激光共聚焦显微镜显示ADSCs在支架上有很好的活性。SDF-1能从SDF-1/PLGA支架中缓慢释放,在第一天,大约60%的SDF-1从PLGA支架中释放,此后维持稳定速度释放,在第30天,仍能检测到SDF-1的释放；而且从PLGA支架缓慢释放的SDF-1能促进ADSCs!的CXCR4的表达,与平面培养相比,在3D环境下ADSCs的CXCR4的表达明显增加。结论：ADSCs在SDF-1/PLGA支架上能良好的生长；SDF-1能有效的从PLGA支架中释放,而且同2D环境下比较,在3D下体外释放的SDF-1更能促进ADSCs的CXCR4表达,将进一步促进ADSCs迁移和归巢,在软骨缺损的再生修复中有广阔的应用空间。第三部分载有ADSCs和SDF-1的PLGA复合体修复兔关节软骨缺损的研究目的：探索ADSCs联合具有缓释作用的SDF-1/PLGA支架能协调作用促进兔关节软骨的修复,延缓再生软骨的退变,探讨移植的同种异体的ADSCs在体内能够存活。方法：取48只新西兰大白兔,在股骨髁髌股关节部位制作关节软骨缺损模型。随机分为3组,每组16只,分别为PLGA组,ADSCs/PLGA组,SDF-1/ADSCs/PLGA组。各组分别于术后第6周和第12周收取包含修复组织的股骨髁,进行形态学、组织学观察。并在12周用RT-qPCR检测修复组织中Aggrecan, Sox9, Collagen type I,II和x等基因表达情况,利用confocal和荧光追踪的方法评估移植的ADSCs的存活情况。结果：和PLGA组、ADSCs/PLGA组相比,SDF-1/ADSCs/PLGA组有最多的再生软骨和GAG含量,其ICRS评分和再生组织的弹性模量显著高于其余两组(P<0.05)；进一步的再生组织的相关基因的检测显示：SDF-1/ADSCs/PLGA组的软骨向Aggrecan, SOX9, Collagen type II基因的量显著高于其余两组(P<0.05),而collagen typeⅠ、X的表达显著低于其余两组(P<0.05)。结论：载有SDF-1的双层PLGA支架联合ADSCs能有效的促进关节软骨缺损的再生修复和界面整合,提高软骨修复质量,而且移植的同种异体ADSCs在软骨缺损部位能存活并参与软骨修复,这种以SDF-1为基础的通过促进干细胞迁移和归巢的组织工程策略将有很好的应用前景。