骨骼肌是运动系统的重要组成部分,其功能的完整及保持对于机体的运动能力具有至关重要的意义。骨骼肌在保持张力大小和收缩速度相对恒定一段时间后,其输出功率会发生降低,做功能力下降。骨骼肌疲劳的最主要特征之一就是张力降低、收缩速度减慢和舒张时间延长。这对于机体运动能力的损害是显而易见的,尤其是在跑步、上下楼等需要骨骼肌维持较强运动功能的活动中极易造成严重后果。导致骨骼肌疲劳的机理非常复杂并涉及到了诸多代谢性或非代谢性的因素,尽管目前已普遍认为肌质网（sarcoplasmic reticulum,SR）对Ca²⁺释放与摄取功能的变化在其中起到了关键性的作用,但其具体机理尚未阐明。骨骼肌疲劳性增加会限制正常的运动能力;老龄人骨骼疲劳性增加是导致老年人行走容易摔倒且并发骨折、甚至生活不能自理的主要原因;在长期太空停留过程中机体也面临着抗重力骨骼肌疲劳性增加带来的危害。探明骨骼肌疲劳性增加的明确机理,可为建立减轻骨骼肌疲劳、加快运动功能恢复的有效措施奠定基础,对于保护骨骼肌运动能力和促进中长期载人航天活动开展具有重要的意义和影响。为此,本研究以骨骼肌疲劳与恢复过程中肌质网Ca²⁺转运功能变化为主要目标,建立了离体骨骼肌条电刺激方案,应用离体骨骼肌条收缩功能测量、SERCA酶活性测量技术、蛋白印迹技术等方法,观测了正常大鼠、尾部悬吊大鼠、甲亢大鼠比目鱼肌疲劳和疲劳恢复过程中重要收缩功能参数的变化及其异同,初步探讨了导致上述变化的可能机理。主要研究结果为:1.离体比目鱼肌肌条收缩功能实验适宜的电刺激条件本研究表明,大鼠比目鱼肌条在离体条件下对电刺激的电压、刺激持续时间、刺激频率呈现显著的依赖性。在电压8²0 V之间、电刺激持续200μs⁵ ms之间、刺激频率20⁸0 Hz之间规律性较为显著。而刺激电压变化对比目鱼肌肌条的最适刺激频率并未产生明显影响。2.疲劳期间与疲劳恢复过程中TR₇₅延长比值可以作为评判肌质网Ca²⁺释放功能的间接指标在20V电压刺激作用下,疲劳性间断强直收缩期间,对照组比目鱼肌肌条TR₇₅延长比值为2.6倍;采用5 mmol/L咖啡因灌流时,增加肌质网Ca²⁺释放功能后,TR₇₅延长比值亦达3.0倍,较对照组明显增大。采用5 mmol/L Mg₂SO₄灌流15 min或60min后,在抑制了肌质网Ca²⁺释放功能的情况下,TR₇₅延长比值均为2.1倍,较对照组显著减小。此外,工作负荷为30 %,刺激电压20 V,刺激频率100 Hz作用时,此时肌质网Ca²⁺释放功能达到最大,疲劳性强直收缩期间TR₇₅延长比值为2.5倍;进一步增加刺激频率至120 Hz和140 Hz时肌质网Ca²⁺释放功能无法再增加,TR₇₅延长比值为分别为2.7倍和2.3倍。三组均值间无显著性差别。在疲劳恢复过程中,第5 min和第10 min时肌质网Ca²⁺释放功能尚未完全恢复,TR₇₅延长比值分别为1.4倍和1.9倍,与第一次相比显著缩短,在第60 min时肌质网Ca²⁺释放功能完全恢复,其比值为2.4倍,与第一次无显著差异。采用增加或减少肌质网Ca²⁺释放观测TR₇₅变化的方法,表明TR₇₅与肌质网Ca²⁺释放增加或减少存在明确的对应关系,可作为评价肌质网Ca²⁺释放功能的间接指标。3. TR₇₅与SERCA活性亦存在紧密关联4 wk T4处理大鼠的比目鱼肌间断强直收缩更易发生疲劳,其力频曲线右移表明为达到最大收缩张力需增加刺激频率,且在各观测时间点T4组比目鱼肌收缩张力降低幅值均显著高于对照组;单收缩时程TPT与TR₇₅均缩短,强直收缩的TR₇₅也明显缩短。当使用SERCA的特异性抑制剂CPA后,T4组与对照组TR₇₅均显著延长,且两组延长的百分比之间无显著差异;T4组的疲劳指数显著增加,与对照组无显著差别,并且在5.0μmol/L CPA作用条件下增加最为显著。但T4组强直收缩TR₇₅的延长比值与对照组却无显著差别,表明4 wk T4处理后肌质网Ca²⁺释放功能并未发生显著改变。因而上述变化表明在甲亢大鼠中TR₇₅与肌质网SERCA的活性密切相关。4. SERCA活性对间断强直收缩疲劳的调节可能具有双向性T4组SERCA酶活性较对照组增高了35.6 %。采用SERCA的特异性抑制剂CPA作用后,在1.0μmol/L浓度下,强直收缩疲劳指数即可恢复到对照组水平,而在5.0μmol/L浓度下其疲劳指数远远高于对照组,但是当浓度达到10.0μmol/L时,其疲劳值数又发生降低。这表明适度抑制SERCA活性有助于增强骨骼肌对疲劳的抵抗性,但过分抑制SERA活性后又会降低这种抵抗作用。5.去负荷和CPA对大鼠比目鱼肌疲劳性的影响在未用CPA灌流时,与对照组相比,悬吊组张力降低的速度比对照组快35.3 %。当分别用1-,2-,5-μmol/L CPA灌流时,无论是对照组还是悬吊组,张力降低的速度都逐渐增加。与此相反的是,10.0μmol/L的高浓度CPA却会延缓张力的降低。无论是何种浓度的CPA灌流,与对照组相比,悬吊组张力降低的速度都更慢了。2-,5-,10-μmol/L CPA灌流时,悬吊组张力降低的速度基本恢复到了未用CPA灌流的对照组的水平。CPA对于延长单次收缩的时程作用在对照组与悬吊组无显著差异。与未用CPA灌流相比,1-,2-,5-μmol/L CPA灌流后对照组比目鱼肌单次收缩的TPTs分别延长了4.2%, 13.1%,和26.7%,在悬吊组大鼠则分别延长了4.0%, 11.3%和24.2%。对照组大鼠比目鱼肌TR₇₅分别延长了9.7%, 53.4%,和121.6%,悬吊组延长了9.3%, 55.6%,和117.5%。与对照组相比,悬吊组比目鱼肌强直收缩的TR₇₅降低了38%。与未采用CPA灌流组相比,1-,2-,5-μmol/L CPA灌流后对照组比目鱼肌强直收缩的TR₇₅s分别延长了19.3%, 52.7%,和70.5%。值得注意的是,悬吊组TR₇₅分别延长了7.6%, 37.4%和73.1%。6.温度对对照组比目鱼肌张力降低和收缩时程的影响将27°C灌流液温度条件下单次收缩的TPT和TR₇₅值设定为100 %。在22°C时,TPT和TR₇₅分别增加了50 %和70 %,但是在35°C,却分别减少了37.5 %和52.3%。间断强直收缩时张力在22°C大于27°C,然而在35°C时却大大低于27°C。对照组大鼠比目鱼肌在22°C时,强直收缩TR₇₅平均值是345 ms,在27°C和35°C时均显著缩短。此外,35°C灌流条件下,无论是对照组还是悬吊组比目鱼肌,活性氧簇清除剂Tiron （5.0 mmol/L）对第5 min最大张力降低速度并无明显作用。7.咖啡因、灌流液Ca²⁺浓度、A23187对间断强直收缩张力降低速度的影响1.0或5.0 mmol/L咖啡因对对照组或悬吊组比目鱼肌张力降低速度均无影响。与采用2.25 mmol/L Ca²⁺灌流相比,将灌流液Ca²⁺浓度提高到3.5 mmol/L,强直收缩张力呈现增高的趋势,尽管无显著的统计学差异。使用1.0μmol/L A23187灌流后,对照组与悬吊组比目鱼肌的强直收缩张力均显著增加。8.去负荷比目鱼肌收缩对细胞外Ca²⁺依赖性增加用不含Ca²⁺的灌流液灌流后,随着收缩时间的延长,对照组大鼠比目鱼肌仍能够较好地维持初始张力,而悬吊组大鼠比目鱼肌从第5 min左右开始张力出现明显降低,并随时间的延长而逐渐加重,至20 min时,最大张力降低至初始张力的82.8±5.7 %,而此时,对照组张力仍保持在初始张力的95.6±2.6 %。用含2.25 mmol/L Ca²⁺的灌流液恢复灌流后,去负荷比目鱼肌张力增高程度显著高于对照组。在第20 min时,对照组比目鱼肌张力仅呈现轻度增加趋势,而去负荷组比目鱼肌张力自第5 min开始就明显增加,至第20 min时,张力增加到初始张力的147.4±9.66 %。9.去负荷比目鱼肌DHPR与RyR表达水平的变化悬吊4周组比目鱼肌DHPR的α1c亚基表达显著高于同步对照组;DHPRα1s亚基的表达与同步对照组相比呈现明显降低趋势,且悬吊4周组显著低于悬吊2周组。与同步对照组相比,去负荷4周比目鱼肌DHPRα1s亚基的表达量与DHPR表达总量相比显著降低,且显著低于悬吊1周和悬吊2周组。与同步对照组相比,悬吊2周、4周组比目鱼肌中RyR表达水平明显降低,与EDL和心肌中的表达水平相当的水平接近。综上所述,肌质网Ca²⁺释放功能和SERCA活性均对骨骼肌收缩功能,尤其是与疲劳特性紧密相关的张力、收缩时程等参数具有重要的影响,能够调节骨骼肌对疲劳的抵抗性,并且这种复杂的调节作用可能具有双向性。去负荷比目鱼肌疲劳性增加可能是由于DHPR与RyR表达水平改变,进而通过兴奋-收缩脱耦联影响肌质网Ca²⁺转运功能。