研究背景：骨肉瘤是常见于青少年的恶性骨肿瘤,好发于长骨干骺端,且恶性程度高,极易发生远处转移,但淋巴结转移较为少见。转移性骨肉瘤对常规化疗耐受,约超过30%的转移性骨肉瘤对化疗无反应。目前骨肉瘤的治疗方案包括新辅助化疗、手术切除病灶(包括转移灶)和术后化疗。慢性炎症是肿瘤生成的一个重要因素,甚至与肿瘤的复发有密切关系。感染或损伤导致的慢性炎症可引起正常细胞恶变,导致DNA损伤、原癌基因激活或抑癌基因失活,进而促进肿瘤的发生。因此炎症因子和炎症信号通路与骨肉瘤的发生密切相关。骨肉瘤转移的发生最初是肿瘤细胞从原发病灶脱落,而后随血液循环到达身体各处,细胞之间相互粘附以及细胞和基质之间相互作用,进而形成远处转移病灶。因此,细胞间及细胞和基质之间的细胞粘附分子在骨肉瘤转移的过程中起到重要作用。细胞粘附分子包括5个家族,分别是钙粘素、整合素、选择素、CD44、免疫球蛋白超家族等。骨肉瘤远处转移中另一个重要过程是病灶内新生血管的生成,若没有新生血管形成,肿瘤的生长不超过1～2mm。因此,控制肿瘤新生血管生成已成为控制肿瘤转移的一个重要途径。人类血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A, SAA)基因家族由四个离散位点构成,其中包括两个高度同源基因SAA1和SAA2以及两个相对不相关基因SAA3和SAA4。SAA1和SAA2在启动子区域、外显子及内含子有95%的重叠序列,非等位基因位点编码的是非糖基化SAA蛋白,其二者所表达的蛋白是急性期循环中的主要蛋白。SAA3基因被认为是一个不表达的基因,但最近有研究发现其可在乳腺上皮细胞内表达。SAA4基因是一种构成型的基因,其产物是一种正常的非急性期的高密度脂蛋白。基因SAA1、SAA2和SAA4在人平滑肌细胞及人单核/巨噬细胞系中被诱导表达,此外,也表达于一些人肿瘤细胞系。小鼠的四个SAA基因均聚集于7号染色体上,且在肝脏表达,而SAA3基因仅在小鼠肝外组织中表达。和其他急性期蛋白一样,SAA主要表达于肝脏,因此,近年来许多动物和细胞实验均在肝细胞内研究SAA的表达和调节。此外,一些研究表明SAA可表达于人动脉粥样硬化病灶中的内皮细胞、平滑肌细胞和单核/巨噬细胞系。近来,有证据表明SAA可表达于正常组织(尤其是上皮组织和内皮组织)、淋巴结、肿瘤组织、阿尔茨海默病脑组织、风湿性关节炎滑膜组织等。这些肝外组织所表达的SAA具有重要意义,因为这些SAA蛋白不是见于能够引起系统急性期的反应,这或许和其表达相关位点有关。SAA基因表达的调控是一个复杂的过程,各种细胞内外的信号参与其中。SAA基因表达主要在转录水平调节,松节油、内毒素脂多糖、各种促炎细胞因子白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、合成的糖皮质激素地塞米松、佛波醇酯、轻度修饰的低密度脂蛋白等多种因素,单独或联合均可影响SAA表达的调控。IL-1,TNF-α和IL-6受体进行信号转换后可诱导一系列转录因子的表达,这些转录因子包括SAA活化序列结合因子,胞嘧啶-胞嘧啶-腺嘌呤-腺嘌呤-胸腺嘧啶(CCAAT)增强子结合蛋白,核因子-κB及SP1。除此之外,SAA的表达或许还受转录后水平的调节,研究表明鞘磷脂神经酰胺途径和巨噬细胞特异性细胞表面受体CD36也是通过以上转录因子参与调节了SAA转录后的表达。通过促进粒细胞、淋巴细胞和单核/巨噬细胞分泌的IL-1b、IL-1受体拮抗剂、IL-8、IL-10、 IL-12、IL-23和TNF-α的生成,SAA可表现出类似细胞因子样的属性。以上发现表明,SAA基因表达是复杂的且涉及多个分子机制,且其血清表达水平与生物学功能有关。血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A, SAA),作为炎症相关反应淀粉样变性的前体蛋白,是一种急性期反应物,在机体受到不同损伤如创伤、感染、炎症和新发肿瘤后,其血清水平会迅速升高1000倍以上。SAA主要由肝脏分泌,是一种与高密度脂蛋白(HDL)相关的载脂蛋白。SAA在正常组织、动脉粥样硬化性组织、阿尔茨海默病组织、炎症组织以及肿瘤组织中均可表达。SAA可在不同生理和病理过程如炎症、动脉粥样硬化、栓塞、淀粉样变性、风湿性关节炎和肿瘤形成中的起到重要作用。健康人中血清SAA呈较低水平,而在亚临床感染、炎症甚至是营养不良的状态下,其水平会随时间出现波动,但不会随年龄增加而升高,80岁以上老年人血清SAA水平升高是与炎症和一些肿瘤性疾病有关,而非与年龄本身。转移性和局限性疾病的区别主要在于肿瘤类型以及组织学分类,如腺癌、鳞癌、肉瘤、淋巴瘤和急性白血病等。SAA水平升高可见于肺癌(鳞状细胞癌、腺癌、燕麦细胞癌和未分化性大细胞癌)、前列腺癌、结直肠癌等,这表明SAA可作为一个非特异性肿瘤标记物及单变量和多变量分析的独立诊断因素。有研究者认为,SAA可作为肾细胞癌远处转移的一个指标,而非早起肿瘤标志物,Rosenthal和Sullivan甚至建议将其作为播散性和局部或区域性疾病的生化标志物。Biran等人发现SAA浓度与肿瘤活性、分期以及预后具有一定的联系。起始SAA浓度具有一定预测价值：小于10mg/ml则患者预后较好,而高浓度则预示预后较差,胃癌患者SAA血清浓度超过97mg/ml,则死亡风险增加4倍。另一个针对不同肿瘤患者的研究显示,SAA升高更多见于危重患者[71],而乳腺癌患者(Ⅰ-Ⅲ期)急性期反应不明显。肿瘤患者在接受人重组白细胞介素6(rIL-6)抗肿瘤治疗后,其SAA水平可出现显著增高,在应用rIL-6的最初一周内,SAA升高水平呈剂量依赖性,并且在第3天达到顶峰。然而,在接下来几周的免疫治疗期间,SAA水平缓慢下降。而应用rIL-3治疗Ⅲ/Ⅳ卵巢癌患者仅会轻微升高SAA水平。在结直肠癌肝转移的患者中,部分肝切除可导致血清SAA水平增加,这或许是肝蛋白质组改变后的结果。腹腔镜辅助的远端胃切除术和开腹远端胃大部切除术,在术后均可出现SAA水平升高,但腹腔镜辅助的远端胃切除术组患者SAA水平增加较少。胃癌患者SAA平均浓度同样也较高,并且浓度与肿瘤分期及定位有一定相关性,因此SAA不仅是评价胃癌患者预后的一个有效指标,而且也是一个有价值的术后随访手段。多发性骨髓瘤患者血清SAA水平也同样高于正常,然而,肿瘤患者出现发热性嗜中性球减少症时,SAA能否作为一个特异性临床标志物仍有待商榷。在肾细胞癌中应用微阵列基因表达分析发现,SAA升高可达30倍以上。对肺癌患者样本进行抗体微阵列分析,我们发现SAA水平升高2倍。一项包括10类实体肿瘤如胃、结肠、胰腺、前列腺、乳腺、卵巢、睾丸、肺、内分泌和肉瘤以及3类血液恶性肿瘤如霍奇金病、非霍奇金病和白血病在内研究显示,不同肿瘤患者的SAA水平虽存在差异,但都高于正常值。SAA被认为是区别前列腺肿瘤患者是否出现骨髓转移的一个血清生化标记物,且前列腺特异性抗原血清浓度对最初诊断有重要价值。同样地,成骨细胞样人骨肉瘤细胞系(SAOS-2和MG-63)在细胞因子介导的刺激下可表达SAA,其中SAOS-2细胞系在无刺激下也可表达。SAA激活因子-1(SAF-1)是SAA的一个转录调节因子,同样可表达于骨肉瘤细胞,无论细胞因子刺激与否。SAA与骨肉瘤的发生密切相关,因此,本研究的主要目的在于研究SAA对骨肉瘤发生的影响及其可能的信号通路机制。研究目的1.通过转染SiRNA,探讨抑制SAA对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的影响；2.探讨SAA与整合素αvβ3间的相互联系；3.通过体内实验明确SAA对骨肉瘤的影响及其相关信号通路。研究方法：1.细胞培养人骨肉瘤细胞购自美国菌种保藏中心,用含10%胎牛血清的DMEM于37℃,5%CO2中培养。2.SiRNA转染体外培养人骨肉瘤细胞,用转染试剂Lipofectamine2000转染FPRL-1siRNA,使细胞内FPRL-1受体低表达或抑制,48小时候后收集细胞,以备western检测和real-time PCR检测。3. Western blot检测首先倒掉培养液,向培养瓶或孔板中加入含PMSF的RIPA裂解液,用细胞刮刀刮下细胞,转移至经过处理的干净EP管中；若为悬浮细胞,则收集含有细胞的培养基,以1000r/min的转速离心5min,倒掉上清,加入含PMSF的RIPA裂解液；加入裂解液的量一般为小培养瓶：1ml/瓶；6孔板：200ul/孔；12孔板：80ul/孔；冰上孵育15-30min；在4℃条件下,13000r/min离心10min；将上清转移至新EP管中,按比例加入蛋白上样缓冲液；99℃煮10min,-80℃储存。仔细清洗并烘干玻璃板,将其对齐并放入夹中卡紧,确保两块玻璃板的下沿在一个平面；按照比例配制10%的分离胶,按顺序分别加入30%Acr/Bic. Tris-HCl (pH8.8)、三蒸水、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED;加入TEMED后立即涡旋震荡混匀,灌入两块玻璃板中,异丙醇压气泡；约半小时左右,待分离胶凝固后,将异丙醇倒掉,蒸馏水冲洗数次,并将残余的水吸干；按照比例配制5%的基层胶,按顺序分别加入30%Acr/Bic、Tris-HCl (pH6.8)、三蒸水、10%SDS、10%过硫酸铵、TEMED;加入TEMED后立即涡旋震荡混匀,灌入两块玻璃板中,插上相应的梳子。将配好的胶连同玻璃板一起放入装有电泳缓冲液的电泳槽中,双手小心将梳子从胶中拔出,确保电泳液的液面超过玻璃板上沿；解冻蛋白,上样前99℃再次加热5min,震荡混匀；每孔加入适量体积的蛋白提取液,在两侧孔中加入3μ l蛋白Marker。首先以90V电压电泳；待Marker指示带分离后,将电泳的电压改为120V；待溴酚蓝即将到达分离胶最下沿时停止电泳。按实验目的,根据Marker的指示带切除多余的胶；按一下顺序将含有目的蛋白的胶放入转膜夹中：夹子黑面-海绵-滤纸-胶-NC膜-滤纸-海绵-夹子红面,确保各层之间无气泡；将转膜夹按正负极顺序放入转膜槽中,200mA冰上转膜1.5h。用脱脂奶粉配制5%的封闭液；取出条带,放入封闭液中,摇床上常温摇晃1-2h。取出条带,摇床上1×TBST洗5min×3次；放入适当浓度的一抗中,4℃摇床过夜。取出条带,摇床上1×TBST洗5min×3次；放入适当浓度的二抗中,常温摇床摇晃2h。将发光液的A液和B液等体积混合；将NC膜铺放在包裹铅板的保鲜膜上,滴加发光液后即出现荧光；把裁好的胶片与发光面结合,依据荧光强度曝光适当时间后,把胶片依次放入显影液和定影液中；扫描,拍照。4.实时定量PCR (real-time PCR)检测根据GeneBank中查询到的人FPRL-1的cDNA序列,委托上海博尚生物有限公司设计FPRL-1的引物为：上游5’-CAC GGCCACATTACCATTCCT-3’;下游5’-AGCGGTCCAGTGCAATGA AA-3’, αvβ3引物为：上游5’-GCTTCAAGGACA-GCCTGATCG-3’下游5’-CTTTATACAGTGGGTTGTTGGCTG-3’;选择18S作为内参,其引物设计为上游5’-CTTAGTTGGTGGAGCGATTTG-3’;下游5’-GCTGAACGCCACTTGTCC-3’。使用天根总RNA提取试剂盒,根据推荐使用条件,从U20S细胞中抽取总RNA。RNase处理所有需要用到的器具；取1ml Trizol液加入对数期生长的野生型RAW264.7细胞,用细胞刮刀刮下细胞后均匀吹打,室温静置10min；将静置后的液体转移至新EP管中,加入200μl氯仿,涡旋震荡使之充分混匀,冰上放置5min;4℃条件下,以14000rpm的速度离心15min;将上层液体0.5ml转移到RNase处理过的干净EP管里,并加入等体积异丙醇,继续冰上孵育30min；4℃条件下,以14000rpm的速度离心15min；弃上清液,并加入1ml75%乙醇,对沉淀充分洗涤；4℃条件下,以12000rpm的速度离心15min;去除乙醇,取10μl经DEPC处理过的三蒸水以溶解下层的沉淀,紫外分光光度计测定提取的RNA浓度；-80℃中保存。5.刮伤愈合实验细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中生长。细胞以一定密度接种到6孔细胞培养板中,生长24小时后,单层细胞融合度应达到70-80%。不要更换培养基。用新的1ml枪头轻轻的在单层培养细胞间划痕,划痕横穿过孔,枪头尽量与板孔的底部垂直,不要倾斜。这样产生的gap的距离才与枪头末端的外直径相等。Gap的距离可以选用不同型号的枪头调节。划痕在同一方向成一条直线。在垂直与第一条划痕的方向制作另一条划痕,每孔划痕成十字交叉型。划痕后,用培养基轻轻的清洗板孔2次,以去除脱落细胞。每孔添加新鲜培养基。培养基中含有某些成分,如抑制/促进细胞迁移和/或增殖的化学物质。细胞生长48小时(或根据时间需要)。1xPBS清洗细胞两次,然后使用3.7%多聚甲醛固定30分钟。0.1%的结晶紫(2%乙醇溶解)染色30分钟。染色的单层细胞选取不同的视野,显微镜拍照。gap的距离可通过Photoshop或ImagJ软件测量.为了降低实验结果的可变性,建议每孔选择多个视野观察,每组做多个重复。6. Transwell实验取传代第二天长势良好的U20S细胞,无血清培养基轻柔漂洗两次；加入无血清培养基,37℃,5%CO2培养24h～48h,收集细胞培养上清；4℃,12000rpm离心,10min,取上清；0.22μm滤膜过滤除菌；分装,在-20℃保存。-20℃保存的Matrigel在冰上保2℃～8℃过夜融化。在冰上用预冷的枪头吸取100μl Matrigel加入冰预冷的300gl无血清培养基中,充分混均。取上述稀释的Matrigel25μl加入transwell板上室,覆盖整个聚碳酯膜,37℃,30min,使Matrigel聚合成胶。已铺好Matrigel的transwell培养板置于37℃可保存2周。刺激后的各组细胞用PBS漂洗3次。以常规方法用无血清培养基制备单细胞悬液,5x105个细胞/ml,每组细胞各分为两部分。胎盘兰拒染实验,细胞活力需大于95%。Transwell培养板上室加入100μl细胞悬液(5×104个)并加入无血清培养基200u1。Transwell培养板下室加入500μl趋化因子,37℃,5%CO2培养24h。用湿棉签轻轻擦去Matrigel凝胶和聚碳酯膜上表面的细胞。小心取出上室,用线拴住,并做好标记,用冰预冷的甲醇固定30min。苏木素染色1min。梯度乙醇脱水(80%,95%,100%),二甲苯透明。小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来,置载玻片上中性树脂封片。附着于聚碳酯膜下表面的细胞在高倍镜下(×400)随机取6个视野计数,取平均数。重复实验两次。7.统计学分析全部数据输入SPSS13.0软件包,进行统计分析。计量资料以均数±标难差表示,两组比较采用独立样本t检验,多组样本比较采用方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1.SAA对骨肉瘤(U2OS)细胞的迁移与侵袭的影响伤口愈合实验中,SAA组细胞划痕明显小于对照组,表明SAA可诱导U2OS细胞的迁移。Transwell实验中,SAA组细胞计数多于对照组(P<0.05),表明SAA可促进U20S细胞的侵袭。2.SAA在mRNA和蛋白水平对ανβ3表达的影响Western blot结果显示,以浓度为0.1μg/ml的SAA刺激后,ανβ3的表达未有明显变化。当SAA刺激浓度提高到1μg/ml和10μg/ml时,ανβ3的表达与对照组相比有了明显的增加(P<0.05)。以10μg/mlSAA刺激3、6、9、12、16、24h,在6h,12h和24h后,ανβ3的表达与对照组相比有了明显的增加(P<0.05)。real-time PCR检测结果显示,在SAA浓度为1μg/ml和10μg/ml时,ανβ3在mRNA表达水平明显增加(P<0.05)。以10μg/mlSAA刺激1、3、6、12h,在6h和12h后,ανβ3的表达与对照组相比有了明显的增加(P<0.05)。以上数据表明,SAA诱导ανβ3的生成在蛋白和mRNA水平均呈现浓度和时间依赖性。3.ανβ3抑制剂LM609对SAA诱导的细胞迁移和侵袭的影响迁移实验结果显示,ανβ3的表达在对照组、LM609组及LM609+SAA组中均无明显差异(p<0.05),表明LM609可明显抑制SAA诱导的U2OS细胞迁移。同样的,在Transwell实验中得到了相似的结果。表明ανβ3在SAA诱导的U2OS细胞迁移和侵袭中起到不可或缺的作用。4.ERK1/2信号通路介导SAA诱导的ανβ3的表达用浓度为10mg/ml的SAA刺激U20S细胞,在5min、15min、30min、60min和120min时停止刺激,western blot结果显示MAPK家族三个成员的表达均有明显增加(P<0.05)；刺激5-30min后,MAPK家族三个成员的活性均迅速增加,而刺激1-2h后,活性则缓慢下降。分别用JNK、p38和ERK信号通路特的异性抑制剂SP600125(50μmol/L)、SB203580(10μmol/L)和PD98059(20μmol/L)预处理U20S细胞后,Western blot结果显示仅PD98059(ERK1/2特异性抑制剂)能够明显抑制SAA诱导的ανβ3表达。以上结果表明,MAPK家族三个成员均可被SAA激活,但仅ERK1/2信号通路参与U2OS细胞的反应。5.FPRL-1参与SAA诱导ανβ3的生成用FPRL-1siRNA预处理U2OS细胞后进行real-time PCR和western blot检测,结果显示FPRL-1siRNA可在蛋白和mRNA水平有效下调FPRL-1水平(p<0.05)。百日咳毒素和WRW4也用于处理U20S细胞,结果显示ανβ3表达水平下降(p<0.05)。结果表明上述三种试剂均可抑制SAA诱导ανβ3的表达,这进一步表明FPRL-1参与了SAA诱导ανβ3的表达。结论1.SAA通过整合素ανβ3促进U2OS细胞的迁移和侵袭；2.SAA诱导ανβ3的表达呈浓度和时间依赖性；3.SAA通过FPRL-1/ERK1/2信号通路诱导ανβ3的表达。