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卵巢癌的发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌,在妇科恶性肿瘤中排名第三。由于卵巢位置处于盆腔深部,卵巢癌病情隐匿,缺乏早期的特异表现和成熟的早期筛查方法,发现时多已到晚期,其5年生存率约为40%~45%,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢癌的发病机制尚不明确,目前研究认为卵巢癌不是一个单独的疾病,而是可以根据形态学和分子遗传学差异进行分组的一组疾病,因此,寻找敏感及特异的分子标志物,对于卵巢癌的针对性治疗,提高患者生存率,至关重要。miRNAs是一类长约19-25个核苷酸、高度保守的、非编码的单链RNA,大量研究证明,miRNAs在各种恶性肿瘤的发生、发展中起着重要作用。has-miR-122-5p(下文简称miR-122)在多种肿瘤中低表达,包括胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等,其通过作用于下游的靶基因,抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移,近来有报道显示,miR-122在卵巢癌血清中低表达,预示着miR-122在卵巢癌中可能发挥抑癌的作用。但其在卵巢癌中的作用机制尚缺乏研究。因此,本研究拟探讨miR-122在卵巢上皮癌组织以及正常卵巢组织中的表达情况以及miR-122的表达水平与卵巢上皮癌患者临床病理特征、预后的相关性;采用体内外实验检测miR-122对卵巢上皮癌细胞生物学行为的影响并进一步探讨其可能的作用机制。研究结果将为明确卵巢癌的诊治提供前期实验基础。第一部分miR-122在卵巢上皮癌组织中的表达及临床意义目的:研究miR-122在卵巢上皮癌组织中的表达情况,并探讨miR-122表达水平与卵巢上皮癌患者临床病理特征及总生存期的关系。方法:1.采用q RT-PCR法检测42例卵巢浆液性癌组织和36例正常卵巢组织中miR-122的表达水平。2.根据miR-122的表达情况,分为miR-122高表达组和miR-122低表达组,分析miR-122的表达水平与卵巢浆液性癌患者临床病理特征和总生存期的相关性。结果:1.miR-122在卵巢浆液性癌组织和正常卵巢组织中的表达水平q RT-PCR结果显示:miR-122在正常卵巢组织中的表达水平为1.03±0.21,在卵巢浆液性癌组织中的相对表达水平为0.56±0.10,与正常卵巢组织相比,卵巢浆液性癌组织中miR-122的表达水平明显降低(P<0.05)。2.miR-122的表达水平与卵巢浆液性癌患者临床病理特征的相关性在卵巢浆液性癌组织中,组织学分级G3组患者miR-122的高表达者为40.6%明显低于G1+G2患者的80.0%(P<0.05),淋巴结转移阳性卵巢浆液性癌组织miR-122高表达的比率明显低于淋巴结转移阴性者(26.7%vs 63.0%)(P<0.05)。miR-122的表达与患者的年龄、分期无明显相关性(P>0.05)。3.miR-122的表达水平与卵巢浆液性癌患者总生存期的相关性miR-122高表达组卵巢浆液性癌患者的中位生存时间(32.2±1.6月)较miR-122低表达组患者(25.3±2.0月)明显延长(P<0.05)。结论:1.miR-122在卵巢浆液性癌组织中的表达明显低于正常卵巢组织,表明miR-122与卵巢浆液性癌的发生有相关性。2.miR-122低表达与卵巢浆液性癌患者的组织学分级、淋巴结转移和生存时间相关,表明miR-122可能参与卵巢浆液性癌的侵袭转移,可作为判断预后的分子标志物。第二部分miR-122对卵巢上皮癌细胞生物学行为的影响及机制目的:通过调节miR-122在卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3中的表达情况来探讨其对卵巢癌细胞生物学行为的影响及其可能的机制。一、miR-122对卵巢上皮癌细胞生物学行为的影响方法:将miR-122 mimics和inhibitor转染卵巢上皮癌细胞,并分别设有阴性对照组。实验分为五组:miR-122 mimics组、miR-122 mimics NC组、miR-122 inhibitor组、miR-122 inhibitor NC组和parental组。q RT-PCR检测miR-122的表达水平,CCK8法、划痕实验、Transwell实验检测miR-122对卵巢上皮癌细胞生物学行为的影响,Western blot检测卵巢癌细胞上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition EMT)相关蛋白E-cadherin、vimentin表达水平,检测MMP2、MMP14表达水平,分析miR-122对卵巢癌细胞EMT的影响。结果:1.本研究通过Lipofectamine?2000转染试剂将miR-122 mimics和inhibitor转染SKOV3和OVCAR3细胞。q RT-PCR技术检测miR-122的表达水平。结果显示在SKOV3细胞中,与miR-122 mimics NC组相比,miR-122 mimics组miR-122的表达水平明显升高(P<0.05)。而inhibitor组miR-122的表达水平明显低于inhibitor NC组,差异具有显著性(P<0.05)。在OVCAR3细胞中得到相同的结论,提示转染成功,细胞可用于后续的实验研究。2.CCK8实验结果显示,转染后48h,72h,miR-122 mimics组较miR-122mimics NC组SKOV3和OVCAR3细胞增殖能力明显降低(P<0.05),与miR-122 inhibitor NC组相比,miR-122 inhibitor组可显著提高SKOV3和OVCAR3细胞的增殖能力(P<0.05)。3.Transwell小室迁移实验结果显示,miR-122 mimics组高倍镜视野下的SKOV3和OVCAR3细胞数较miR-122 mimics NC相明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-122 inhibitor组与相应对照组相比,高倍镜视野下的SKOV3和OVCAR3细胞数明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。4.划痕实验结果显示:miR-122 mimics组SKOV3和OVCAR3细胞迁移率明显下降(P<0.05),miR-122 inhibitor组SKOV3和OVCAR3细胞迁移率明显升高。(P<0.05)。5.Westeren blot结果显示:miR-122 mimics组,EMT相关蛋白E-cadherin的表达量明显升高(P<0.05),vimentin、MMP2、MMP14表达水平明显降低(P<0.05)。miR-122 inhibitor组,EMT相关蛋白E-cadherin的表达量明显降低(P<0.05),vimentin、MMP2、MMP14表达水平明显升高(P<0.05)。二、寻找miR-122下游的作用分子方法:检索miRNA数据库发现脯氨酸4-羟化酶亚基α-1(Prolyl-4-hydroxylase subunit alpha-1,P4HA1)为miR-122潜在的靶基因。体外构建含有P4HA1-3’UTR序列或其突变序列的荧光报告载体,与miR-122mimics序列共转染至293T细胞,测定各组Firefly荧光值和Renilla荧光值,并计算Firefly/Renilla。q RT-PCR和Western blot方法检测转染miR-122 mimics、miR-122inhibitor后卵巢癌细胞P4HA1 m RNA及蛋白表达情况,体外验证miR-122可靶向作用于P4HA1 m RNA3’UTR,并抑制卵巢上皮癌细胞中P4HA1的表达。结果:1.荧光素酶报告基因分析显示,在SKOV3细胞中,与UTR+miR-122mimics NC组相比,UTR+miR-122 mimics组,荧光素酶活性明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。而UTR(mutant)+miR-122 mimics组与UTR+miR-122 mimics NC组荧光素酶活性均无明显差异(P>0.05),证实miR-122与P4HA1的靶向关系。2.转染miR-122 mimics后,P4HA1的表达在转录和翻译水平均明显下降(P<0.05),而转染miR-122 inhibitor后,其表达水平均明显升高(P<0.05),证实了miR-122可靶向作用于P4HA1的3’UTR区并引起P4HA1表达下调。三、miR-122抑制卵巢上皮癌细胞EMT的机制方法:通过将P4HA1过表达质粒或其对照载体转染卵巢上皮癌细胞,q RT-PCR检测细胞P4HA1 m RNA表达水平,western blot检测细胞P4HA1蛋白表达水平,评估转染效果。进一步分析miR-122是否通过调节P4HA1的表达影响卵巢癌细胞的生物学行为,miR-122 mimics或其阴性对照与P4HA1过表达载体或对照空载体共转染卵巢癌细胞,实验分为4组,分别为:miR-122 mimics NC+vector,miR-122 mimics NC+P4HA1,miR-122mimics+vector,miR-122 mimics+P4HA1。CCK-8实验检测细胞增殖,划痕实验及Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力,western blot检测细胞MMP2、MMP14、E-cadherin、vimentin表达水平,分析miR-122抑制卵巢上皮癌细胞EMT的分子机制。再次证明miR-122通过调节P4HA1表达影响卵巢上皮癌细胞生物学行为。结果:1.通过将P4HA1过表达质粒或其对照载体转染SKOV3和OVCAR3细胞,RT-PCR及Western blot检测P4HA1在转录及翻译水平均明显提高(P<0.05),证实质粒转染效果.2.miR-122 mimics或其对照与P4HA1过表达载体或对照空载体共转染卵巢上皮癌细胞后,CCK-8结果显示在第48h、72h后,与miR-122mimics NC+vector组相比,miR-122 mimics NC+P4HA1组SKOV3和OVCAR3细胞的增殖活力均明显升高(P<0.05),miR-122 mimics+vector组卵巢癌细胞增殖能力明显降低(P<0.05)。而与miR-122 mimics+vector组相比,miR-122mimics+P4HA1组SKOV3和OVCAR3细胞的增殖活力明显升高(P<0.05)。且miR-122mimics+P4HA1组增殖活力介于miR-122mimics+vector组和miR-122 mimics NC+P4HA1组之间。3.划痕试验和Transwell迁移显示,SKOV3和OVCAR3细胞中,与miR-122 mimics NC+vector组相比,miR-122 mimics NC+P4HA1组侵袭转移能力明显增强,而miR-122 mimics+vector组侵袭转移能力明显下降(P<0.05),与miR-122 mimics+vector组相比,miR-122mimics+P4HA1组的侵袭转移能力明显增加(P<0.05)。且miR-122mimics+P4HA1组的侵袭转移能力介于miR-122 mimics+vector组和miR-122 mimics NC+P4HA1组之间。4.Westeren blot结果显示:与miR-122 mimics NC+Vector组相比,miR-122 mimics NC+P4HA1组,E-cadherin表达水平明显降低(P<0.05),vimentin、MMP2、MMP14表达水平明显升高(P<0.05)。miR-122mimics+vector组,E-cadherin表达水平明显升高(P<0.05),vimentin、MMP2、MMP14表达水平明显降低(P<0.05)。miR-122mimics+P4HA1组E-cadherin、vimentin、MMP2、MMP14表达水平均介于miR-122mimics+vector组和miR-122 mimics NC+P4HA1组之间。结论:miR-122可通过靶向作用于P4HA1 3’UTR,下调P4HA1的表达来抑制卵巢上皮癌细胞中的细胞增殖、侵袭和迁移,同时抑制卵巢癌细胞EMT的发生。第三部分miR-122对卵巢上皮癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响及机制目的:检测miR-122对卵巢癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力的影响,通过裸鼠体内实验来探讨其在卵巢癌发生发展中的作用机制。方法:构建miR-122过表达质粒与对照载体稳转细胞系,注射到裸鼠腹腔,建立卵巢癌细胞裸鼠成瘤模型。5周后,杀死动物,然后将每只动物解剖,分离出各个脏器,仔细观察每个器官上的肿瘤并拍照,剥除各个肿瘤,记录数据。q RT-PCR检测肿瘤结节miR-122表达水平,western blot检测肿瘤结节P4HA1蛋白表达水平,分析miR-122对卵巢癌细胞动物体内增殖的影响。结果:1.miR-122组裸鼠腹腔肿瘤数目明显减少(P<0.05)。2.RT-PCR结果显示,与对照组相比,miR-122过表达组m RNA水平明显高于对照组(P<0.05)。3.Western blot显示miR-122组裸鼠肿瘤中P4HA1表达水平明显下降(P<0.05)。结论:miR-122能够显著抑制裸鼠卵巢癌移植瘤的生长。总之,miR-122通过靶向作用于P4HA1 3’UTR,抑制卵巢癌细胞的体内外增殖,同时抑制EMT的发生,miR-122有望成为卵巢上皮癌治疗的新的靶点。