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国槐(Sophora japonica L.)为蝶形花科(Papilionaceae)槐属落叶乔木,在我国已有3000多年的栽培历史。国槐的花瓣通常为白色或者浅黄绿色,单调的花色严重的限制了其观赏性。许多研究表明,国槐花瓣中富含黄酮、黄酮醇等物质,但其花瓣中是否含有花青苷?花青苷的种类和含量情况如何?针对这些问题的研究尚未见报道。本课题组经过多年的选育工作,筛选到了一棵粉花突变植株,该植株的旗瓣、翼瓣和龙骨瓣均为粉色,但关于该植株花色发生突变的原因尚不清楚。国槐花瓣中富含芦丁等黄酮类物质,而这些物质是花青苷合成的前体。因此,作者推测该突变植株花瓣中花青苷的含量或种类发生了变化导致了其花色转为粉色。为了证明该推测,本研究以国槐粉花突变(PM)不同时期的花瓣为研究材料,以相应时期的野生型(WT)的花瓣为对照,通过花青苷定性定量分析和转录组测序分析,挖掘了导致PM花色形成的关键基因,并对关键基因的CDS区进行克隆与功能验证。主要研究结果如下:(1)应用HPLC-DAD-MS~2技术测定国槐PM和WT四个时期花瓣中的花青苷与类黄酮的种类和含量。在PM和WT的花瓣中均检测到了两种花青苷和8种黄酮醇。PM和WT花瓣中总黄酮醇的含量差异不显著,但PM中的总花青苷含量显著高于WT中的含量。(2)对PM和WT四个时期的花瓣进行了转录组测序分析。从相同时期PM和WT之间,以及PM相邻时期之间共筛选出12,151条DEGs。对DEGs进行GO和KEGG富集分析,筛选到了14条花青苷合成结构基因,其中编码DFR酶的c150127.graph＿c0可能在PM花青苷积累中起关键作用。此外,该研究还鉴定到了花青苷合成关键调节基因,包括Sj PAP1、Sj MYB111、Sj MYB1b、Sj MYBL2、Sj TTG1、Sj TT8、Sj JAZ3、Sj ERS1、Sj PHYA、Sj HY5、Sj IAA19、Sj AXR3和Sj IAA27等。(3)克隆了关键基因Sj DFR(c150127.graph＿c0)的CDS区,该基因编码339个氨基酸。Sj DFR蛋白序列与其他物种中的DFR蛋白高度同源,并存在NADPH酶结合位点(V10～Y30)和底物特异性结合保守基序(T131～V156)。Sj DFR的转录水平与花青苷含量相关,在花青苷含量高的花瓣组织中高表达。通过农杆菌介导的叶盘法将Sj DFR基因转化烟草。T0代转基因株系花冠颜色均有不同程度的加深,花冠中总花青苷含量均有不同程度的增加,且花青苷含量与Sj DFR转录水平正相关。(4)从国槐中分离了花青苷合成调控关键转录因子Sj PAP1。Sj PAP1与拟南芥R2R3-MYB家族中第六和第七亚组成员亲缘关系较近。构建该基因的植物过表达载体并在烟草中过表达。转基因烟草株系的叶片、花冠以及其他组织的颜色均不同程度地向红色偏移,叶片和花冠中花青苷含量相对于对照组显著增加。转基因烟草花冠和叶片中花青苷合成结构基因以及调节基因Nt AN1a与Nt AN1b的转录水平相对于对照组显著上调。