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纤维素作为地球上最丰富的可再生资源之一,能够被纤维素酶降解生成还原糖,将纤维素降解的产物还原糖进一步制备生物乙醇,不但能够解决当今世界的能源短缺问题,也有助于解决环境问题。由于商品化的纤维素酶价格较高,并且难以进行回收利用,因此,游离纤维素酶降解纤维素一直难以应用于大规模的工业生产,将固定化技术应用于纤维素酶成功的解决了这一问题。实验以甲基丙烯酸(Methyl Acrylic Acid, MAA)、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(2-Dimethylamino Ethyl Methacrylate, DMAEMA)和甲基丙烯酸丁酯(Butyl Methacrylate, BMA)作为三种单体,单体摩尔比例MAA:DMAEMA:BMA为19：1：1,合成了一种新型pH响应聚合物PMDB3.1聚合物PMDB3.1的等电点为3.1,将溶液的pH值调至其等电点,聚合物PMDB3.1的回收率为95.6%。聚合物PMDB3.1上的羧基能够与纤维素酶的氨基发生化学反应,从而将纤维素酶共价结合固定化在pH响应聚合物PMDB3.1上。这种可逆可溶-不可溶载体能够在可溶状态进行纤维素的降解反应,之后通过调节溶液pH值至其等电点,将固定化纤维素酶沉淀,进行高效的回收。实验研究了固定化纤维素酶的最适纤维素酶添加量、最适溶液pH、最适EDC(1,3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺)的添加量以及最适固定化时间,研究发现,当纤维素酶的初始添加量为2.4%(v/v)(150mg蛋白),EDC的添加量为300mg/g PMDB3.1,溶液pH值为6.0,固定化反应4小时后,纤维素酶的酶保留活力最高,达到81.2%。两水相体系(Aqueous Two-Phase Systems, ATPS)由于体系含水量高、操作条件温和、反应在常温常压下进行,并且易于放大和连续化操作等一系列优点,因而常用于分离和纯化生物活性物质。传统的两水相体系由于成相聚合物难以回收利用,因此造成了工业成本的过高和环境的污染,现今,越来越多可回用聚合物被应用于两水相体系中,这些聚合物能够通过调节其理化性质,如温度、pH、离子强度等,使聚合物从可溶状态转变为不可溶状态,通过收集沉淀进行回收,由可回用聚合物形成的两水相体系又被称为可回用两水相体系。在可回用两水相体系中进行纤维素酶降解纤维素的催化反应,一方面能够高效回收固定化纤维素酶和成相聚合物,降低工业成本和环境污染,另一方面,还能够有效的解除单水相体系中酶催化反应过程的产物抑制和底物抑制效应,提高产物得率。将pHH响应聚合物PMDB3.1作为成相聚合物之一,与温度响应聚合物PNB共同制备热-pH响应可回用两水相体系。在PNB/PMDB3.1两水相体系中,pH响应聚合物3.1主要分配在下相,温度响应聚合物PNB主要分配在上相,加入50mM KC1后,葡萄糖在PNB/PMDB3.1两水相体系中的分配系数为3.68。在PNB/PMDB3.1两水相体系中进行固定化纤维素酶降解纤维素的催化反应,当初始底物浓度为0.5%(w/v)时,PNB/PMDB3.1两水相体系中反应达到平衡后的还原糖浓度为2.23%(w/v),糖化率为40.16%,糖化率比单水相体系中的催化反应提高了10.94%。实验以丙烯酸(Acrylic Acid, AA)、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(2-Dimethylamino Ethyl Methacrylate, DMAEMA)和甲基丙烯酸丁酯(Butyl Methacrylate, BMA)为三种单体,单体摩尔比例为AA:DMAEMA:BMA=23:7:1,合成新型pH响应聚合物PADB3.8,能够与PMDB3.1形成新型pH-pH响应可回用两水相体系。当(NH4)2SO4浓度为40mM时,产物还原糖在PADB3.8/PMDB3.1两水相体系中的分配系数为2.45,主要分配在上相。研究发现,在PADB3.8/PMDB3.1两水相体系中进行纤维素酶降解纤维素的催化反应,最适反应温度为50℃,最适初始底物浓度为0.5%(w/v),反应54小时后达到平衡。在最适条件进行纤维素的降解,糖化率54小时能够达到70.57%,比单水相体系中提高了9.3%。水溶性固定化纤维素酶在PADB3.8/PMDB3.1两水相体系中重复使用五次后,纤维素酶降解纤维素的糖化率为66.15%。由于纤维素结构的复杂性,纤维素酶降解纤维素通常需要三种酶的协同作用,内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4),外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)。由于纤维素复合酶中β-葡萄糖苷酶的含量较低,因此将β-葡萄糖苷酶作为补充酶与纤维素复合酶共同固定化在pH响应聚合物PMDB3.1上。实验研究了纤维素复合酶和p-葡萄糖苷酶共同固定化的最适固定化比例为10：1。在PADB3.8/PMDB3.1两水相体系中,用固定化纤维素复合酶和β-葡萄糖苷酶降解纤维素,反应108小时后葡萄糖浓度为4.331mg/ml。固定化纤维素复合酶和β-葡萄糖苷酶在PADB3.8/PMDB3.1两水相体系中重复使用五次后,葡萄糖得率为50.25%。