[目 的]采用SD大鼠开胸后结扎冠状动脉前降支,构建缺血性心衰模型,4周后,分别予以CSWT(体外心脏震波)、PI3K/Akt信号通路特异性阻断剂LY294002、ERK1/2信号通路特异性阻断剂PD98059处理,4周后分别检测心脏重量、NT-proBNP水平,RT-PCR检测mRNA的表达水平,免疫组化测定蛋白表达水平,Masson染色、免疫荧光双染色测定心肌纤维化程度等方法,证实CSWT在治疗心力衰竭大鼠中发挥抑制心肌纤维化的作用,并进一步探讨其可能通过PI3K/Akt,ERK1/2两条信号通路发挥作用进而改善心衰。[方 法]1、分组及处理:随机入选120只成年雄性SD大鼠,体重220-250g,其中10只为假手术组,余下110只大鼠手术开胸,高位结扎冠状动脉前降支,建立SD大鼠缺血性心力衰竭模型。按照建立模型及建模后处理的方式不同,术后四周存活的大鼠分成了 A、B、C、D、E、F、G、H、I九组,A:对照组(10例);B:心衰组(HF组10例)、C:心衰+体外震波组(HF+CSWT组9例)、D:心衰+抑制剂1组(LY294002)(HF+LY294002 组 8 例)、E:心衰+抑制剂 2 组(PD98059)(HF+PD98059组9例)、F:心衰+抑制剂1组(LY294002)+抑制剂2组(PD98059)(HF+LY294002+PD98059组8例)、G:心衰+心脏震波+抑制剂1组(LY294002)(HF+CSWT+LY294002 组 9 例)、H:心衰+心脏震波+抑制剂 2 组(PD98059)(HF+CSWT+PD98059组9例)、I:心衰+心脏震波+抑制剂1组(LY294002)+抑制剂2组(PD98059)(HF+CSWT+LY294002+PD98059组9例)。再予以体外心脏震波治疗,震波能量0.09mJ/mm2,每次200脉冲,频率60次/min,每周三天,每天一次,共4周。其中抑制剂LY294002通过腹腔给药100 mg/kg,抑制剂PD98059通过静脉注射给药10 mg/kg,每周一次。2、检测方法:心脏超声检测术前、术后第4周及干预后4周(即术后8周)各组大鼠心功能,ELISA法测定各组大鼠血清种NT-proBNP水平;根据大鼠心脏形态学及大鼠心脏/体重比来评估心肌梗死范围及程度;运用RT-PCR技术测定各组大鼠心肌组织内的纤维化分子CD34、α SMA的mRNA表达水平;免疫组织化学法检测心肌组织中CD34、α SMA、p-AKT、PI3K/Akt、P-ERK1/2蛋白表达水平。[结 果]1.120只实验SD大鼠中110只进行急性心肌梗死模型制作,另外10只行假手术。急性心肌梗死模型制作中96只存活至造模后4周,假手术10只全部存活,在接受超声心动图检测评估中,73只体现出心肌梗死,心肌梗死后心衰模型成功率为 76.04%。2、心脏/体重比反应大鼠心肌梗死程度(因心肌梗死后心室壁会变薄,心脏重量会减轻):与对照组(1.16±0.01)相比,HF组的心重(1.06±0.01)较前降低(P<0.05),而 CSWT 干预后 HF+CSWT 组(1.11±0.03)较 HF 组(1.06±0.01)心脏重量有所回升(P<0.05),分别加入PI3K/Akt信号通路特异性阻断剂LY294002及ERK1/2信号通路特异性阻断剂PD98059处理后(HF+LY294002组(0.95±0.02)及 HF+PD98059 组(1.02±0.01)),两组均较 HF 组(1.06±0.01)心脏重量明显降低(P<0.05),同时添加了两种信号通路抑制剂的HF+LY294002+PD98059 组(0.69±0.03)的心重比添加一种抑制剂组 HF+LY294002组(0.95±0.02)或 HF+PD98059 组(1.02±0.01)明显降低(P<0.05),且HF+LY294002 组(0.95±0.02)比 HF+PD98059 组(1.02±0.01)降低更明显(P<0.05),HF+CSWT+LY294002 组(0.98±0.01)及 HF+CSWT+PD98059 组(1.03±0.01)相对于HF+CSWT组(1.11±0.03)有明显降低(P<0.05),添加两种抑制剂后 HF+CSWT+LY294002+PD98059 组(0.85±0.01)相较于 HF+CSWT+LY294002 组(0.98±0.01)及 HF+CSWT+PD98059 组(1.03±0.01)任意一组心重都明显降低,(P<0.05),且 HF+CSWT+LY294002 组(0.98±0.01)低于 HF+CSWT+PD98059 组(1.03±0.01)(P<0.05)。3、模型建立后4周,行心脏彩超可见HF组大鼠左室扩大、室壁变薄、室间隔运动幅度明显减弱,左室收缩末期内径(LVEDV)(7.95±0.28)和左室舒张末期内径(LVESV)(5.76±0.20)均较手术前(6.64±0.44、3.20±0.45)升高(P<0.05),FS、LVEF(31.21 ±3.21、53.29±2.41)较术前(51.70±4.4、92.77±2.28)降低(P<0.05);术后8周超声心动图示,与HF组(10.12±0.33、7.85±0.35)相比,HF+CSWT 组 LVEDV 及 LVESV 缩小(8.05±0.46、5.97±0.43),(P<0.05),LVEF、FS(35.36±2.38、58.13±2.91)均较 HF 组(24.31±2.39、40.52±5.22)明显升高(P<0.05);相比于 HF+CSWT 组的 LVEDV、LVESV(8.05±0.46、5.97±0.43),HF+CSWT+LY294002 组的 LVEDV、LVESV 较前扩大(8.29±0.35、6.01±0.35),(P<0.05),而 HF+CSWT 组的 LVEF、FS(35.36±2.38、58.13±2.91)相较于 HF+CSWT+LY294002 组(33.55±1.65、50.35±2.71)升高,(P<0.05);且 HF+CSWT+PD98059 组 LVEDV、LVESV(7.34±0.21、5.04±0.27)相较于 HF+CSWT组(8.05±0.46、5.97±0.43)明显降低,HF+CSWT+PD98059 组 LVEF、FS(40.07±3.21、59.67±4.17)相比于HF+CSWT组(35.36±2.38、58.13±2.91)有所回升,(P<0.05);相比较于 HF+CSWT+LY294002 组(8.29±0.35、6.01±0.35)及 HF+CSWT+PD98059 组(7.34±0.21、5.04±0.27)的 LVEDV、LVESV 值,HF+CSWT+LY294002+PD98059 组(9.54±0.20、7.22±0.21)明显上升,而LVEF、FS 值,HF+CSWT+LY294002 组(33.55±1.65、50.35±2.71)、HF+CSWT+PD98059组(40.07±3.21、59.67±4.17)明显高于 HF+CSWT+LY294002+PD98059 组(28.23±2.76、41.87±3.00)(P<0.05)。4、术前及术后4周、8周,分别测定大鼠血清NT-proBNP水平,相比较于术前对照组(9.058±0.4),术后4周HF组SD大鼠NT-proBNP水平明显升高(27.86±0.70)(P0.05)。术后 8 周,与 HF 组(34.29±2.07)相比,HF+CSWT 组(18.69±1.16)血清 NT-proBNP 水平明显降低,HF+LY294002 组(51.48±1.41),HF+PD98059 组(42.36±1.91)NT-proBNP 水平明显上升(P<0.05),与 HF+CSWT 组(18.69±1.16)相比,HF+CSWT+LY294002 组(31.88±0.74)、HF+CSWT+PD98059组(23.64±1.59)NT-proBNP 水平升高(P<0.05);HF+LY294002 组的 NT-proBNP值(51.48±1.41)低于 HF+PD98059 组(42.36± 1.91)(P<0.05),与 HF+LY294002组(51.48±1.41)及 HF+PD98059 组(42.36±1.91)相比,HF+LY294002+PD98059组NT-proBNP水平(63.65±3.19)明显上升(P<0.05),HF+LY294002+PD98059组(63.65±3.19)相比,HF+CSWT+LY29002+PD98059 组(35.54±1.13)NT-proBNP水平明显降低,(P<0.05),与 HF+CSWT+LY294002 组(31.88±0.74)、HF+CSWT+PD98059 组(23.64±1.59)相比,HF+CSWT+LY29002+PD98059 组(35.54±1.13)血清 NT-proBNP 水平明显升高(P<0.05)。5、RT-PCR法检测CD34、α SMA的mRNA的表达水平:RT-PCR检测结果显示,关于纤维化相关因子CD34、Α SMA的mRNA表达水平,HF组相比对照组要明显升高,HF+CSWT 组(1.24±0.08、1.19±0.01)的 CD34、Α SMA 的 mRNA 水平相比于 HF组(1.71±0.06、2.59±0.16)要明显降低,而HF+LY294002组(2.79±0.10、3.67±0.14)及 HF+PD98059 组(1.90±0.14、3.05±0.16)的 CD34、Α SMA水平的mRNA要比HF组的水平明显要高,且HF+LY294002组的CD34、Α SMA水平(2.79±0.10、3.67±0.14)要低于 HF+PD98059 组(1.90±0.14、3.05±0.16)(P<0.05),相比于HF+LY294002组(2.79±0.10、3.67±0.14)及HF+PD98059组(1.90±0.14、3.05±0.16)的 CD34、Α SMA 的 mRNA 水平,HF+LY294002+PD98059组(3.51±0.03、4.57±0.047)要明显升高,(P<0.05);与 HF+LY294002 组(2.79±0.10、3.67±0.14)及 HF+PD98059 组(1.90±0.14、3.05±0.16)的 CD34、Α SMA 水平相比,HF+CSWT+LY294002 组(1.53±0.12、1.75±0.10)、HF+CSWT+PD98059 组(0.86±0.05、1.49 ±0.01)表达水平明显降低;与HF+LY294002+PD98059 组(3.51±0.03、4.57±0.047)相 比,HF+CSWT+LY29002+PD98059 组(2.43±0.03、1.94±0.04)CD34、α SMA 的 mRNA表达水平明显降低(P<0.05),与HF+CSWT+LY294002 组(1.53±0.12、1.75±0.10)、HF+CSWT+PD98059 组(0.86±0.05、1.49±0.01)相比,HF+CSWT+LY29002+PD98059组(2.43±0.03、1.94±0.04)CD34、Α SMA 的 mRNA 表达水平明显升高(P<0.05)。6、免疫组织化学染色揭示蛋白表达变化情况,与对照组CD34、Α SMA水平(6.76±0.58、5.07±0.30)比较,HF 组(17.13± 1.47、13.90±0.85)明显上升,而p-AKT、P-ERK1/2(1.13±0.03、1.35±0.26)蛋白表达量,HF组(0.28±0.04、0.29±0.06)相比于对照组明显降低(P<0.05);与HF组(17.13±1.47、13.90±0.85)比较,HF+CSWT组CD34、α SMA(10.25±0.48、5.78±0.51)蛋白表达水平明显降低,而HF组p-AKT、P-ERK1/2蛋白表达量(0.28±0.04、0.29±0.06)较 HF+CSWT 组(0.89±0.08、0.78±0.11)明显降低(P<0.05);与 HF+CSWT 组 CD34、Α SMA 值(10.25±0.48、5.78±0.51)比较,HF+CSWT+LY294002组(17.79±0.26、9.92±1.49)、HF+CSWT+PD98059 组(14.06± 1.58、11.86±1.38)均要明显上升(P<0.05),而 HF+CSWT+LY294002 组 p-AKT 蛋白表达量(0.51±0.05)相对于 HF+CSWT 组(0.89±0.08)要明显降低,HF+CSWT+PD98059 组 ERK1/2 蛋白表达量(0.30±0.04)较 HF+CSWT 组(0.78±0.11)同样明显降低,(P<0.05);且 HF+CSWT+LY294002 组的 CD34、Α SMA 值(17.79±0.26、9.92±1.49)要高于HF+CSWT+PD98059 组(14.06± 1.58、11.86±1.38);相比于 HF+LY294002 组(23.62±0.85、25.22±1.44)及HF+PD98059 组(18.80±0.86、27.80±3.12),HF+LY294002+PD98059 组 CD34、Α SMA 蛋白表达水平(26.95±1.49、33.85±3.25)明显升高,(P<0.05),而 HF+LY294002 组的 p-Akt 水平(0.13±0.02)明显高于 HF+LY294002+PD98059 组(0.08±0.02),HF+PD98059 组的 p-ERK1/2 水平(0.11±0.03)高于 HF+LY294002+PD98059 组(0.09±0.01)蛋白表达水平;与HF+LY294002+PD98059 组 CD34、Α SMA 蛋白表达水平(26.95±1.49、33.85±3.25)相比,HF+CSWT+LY294002+PD98059 组(19.47±0.59、14.15±0.70)明显降低;而HF+LY294002+PD98059组p-Akt 及p-ERK1/2 的表达水平(0.08±0.02、0.09±0.01)要明显低于 HF+CSWT+LY294002+PD98059 组(0.30±0.03、0.18±0.05),(P<0.05),CD34、Α SMA 的蛋白表达水平上 HF+CSWT+LY294002 组(17.79±0.26、9.92 ± 1.49)及 HF+CSWT+PD98059 组(14.06 ± 1.58、11.86±1.38)要明显低于HF+CSWT+LY294002+PD98059 组(19.47±0.59、14.15 ± 0.70)(P<0.05),但HF+CSWT+LY294002 组的 p-Akt(0.51±0.05)及 HF+CSWT+PD98059 组 p-ERK1/2(0.30±0.04)的表达水平均高于 HF+CSWT+LY294002+PD98059组的 p-Akt(0.30±0.03)及 p-ERK1/2(0.18±0.05)的表达水平程度(P<0.05)。7、以Masson染色法评估心肌纤维化程度:与对照组(0.07±0.05)比较,HF组(53.89±1.01)纤维化水平明显上升,(P<0.05),而 HF+CSWT 组(23.63±0.54)相比与HF组(53.89±1.01),有明显下降,(P<0.05),而在加入信号通路抑制剂后的 HF+CSWT+LY29002(32.25±3.03)、HF+CSWT+PD98059(29.18±1.73)后,纤维化水平比起HF+CSWT组(23.63±0.54)明显升高,(P<0.05),HF+LY29002组(57.63±3.19)及 HF+PD98059 组 63.99 ±2.00)的纤维化程度比 HF 组(53.89±1.01),水平明显上升(P<0.05),HF+LY29002+PD98059 组(69.66±4.72)的纤维化程度相比 HF+LY29002 组(57.63±3.19)及 HF+PD98059组(63.99±2.00),也有明显上升(P<0.05),HF+CSWT+LY294002+PD98059 组的纤维化程度(45.09±2.12)相比于 HF+CSWT+LY294002 组(32.25±3.03)及HF+CSWT+PD98059 组(29.18±1.73),显著升高(P<0.05)8、免疫荧光双标检测Α SMA/CD34和Procollage-I/CD34表达情况:ΑSMA/CD34,相比于对照组(0.75±0.24、1.07±0.07),HF 组(7.14±0.69、13.44±1.21)的表达水平有明显的升高,(P<0.05);与HF组(7.14±0.69、13.44±1.21)相比,HF+CSWT(5.04±0.77、5.48±0.48)的水平有明显下降,而 HF+LY294002 组(24.21±1.47、16.37±2.13)则呈明显升高趋势,(P<0.05),与HF+PD98059组(8.23±0.45、15.55±0.62)相比,添加了双抑制剂组的HF+LY294002+PD98059 组(35.31±1.59、19.10± 1.64)的 CD34、Α SMA 表达水平明显上升,(P<0.05),而相比于 HF+LY294002+PD98059 组(35.31±1.59、19.10±1.64),使用体外震波治疗后的 HF+CSWT+LY294002+PD98059 组(30.91±1.98、9.16 ± 1.47)的 CD34.α SMA 表达水平有明显降低,(P<0.05),相对于 HF+CSWT 组(5.04±0.77、5.48±0.48),HF+CSWT+LY294002 组(19.67± 1.19、9.31±0.88)及 HF+CSWT+PD98059 组(5.97±0.47、12.37±1.05)的表达水平明显降低,(P<0.05),而相对于HF+CSWT+LY294002组(19.67± 1.19)及HF+CSWT+PD98059组(5.97±0.47),添加了两种抑制剂的HF+CSWT+LY294002+PD98059 组的 α SMA(30.91±1.98)的表达水平有明显升高,(P<0.05);在 Procollage-I/CD34 组,相比于对照组(1.48±0.03、0.54±0.07),HF组(3.45±1.02、1.93±0.47)的表达水平有明显的升高,(P<0.05),与HF 组(3.45±1.02、1.93±0.47)相比,HF+CSWT(0.41±0.16、1.43±0.15)的水平有明显下降,而HF+LY294002组(37.81±4.99、15.01±3.21)则呈明显升高趋势,(P<0.05),而相比于 HF+LY294002+PD98059 组(39.65±7.54、19.05±1.64),使用体外震波治疗后的 HF+CSWT+LY294002+PD98059 组(19.08±2.13、15.09±1.23)的 CD34、α SMA 表达水平有明显降低,(P<0.05),相对于 HF+CSWT 组(0.41±0.16、1.43±0.15),HF+CSWT+LY294002 组(6.26±1.99、13.33±1.53)的表达水平明显降低,(P<0.05),而相对于HF+CSWT+LY294002组(6.26±1.99),添加了 两种抑制剂的 HF+CSWT+LY294002+PD98059 组的Procollage-I(19.08±2.13)的表达水平有明显升高,(P<0.05),而相比于HF+CSWT+PD98059 组(7.03±1.13、1.43±0.15),HF+CSWT+LY294002+PD98059组(19.08±2.13、15.09±1.23)的表达水平明显升高,(P均<0.05)。[结 论]1、手术开胸高位结扎左冠状动脉前降支可以建立平行性良好的大鼠心衰模型,可以为心血管领域提供理想的动物模型。2、予体外震波治疗后的缺血性心衰大鼠,能显著提高左室射血分数,降低NT-proBNP、CD34、α SMA表达水平,升高p-Akt、p-ERK的表达水平进而抑制心肌纤维化,总之,CSWT可抑制心室重构、降低心肌纤维化程度,从而改善心力衰竭后的大鼠心功能,改善预后。3、CSWT通过激活PI3K/Akt、ERK1/2信号通路抑制心肌纤维化进程从而改善心功能,降低心力衰竭程度,并且PI3K/Akt、ERK1/2信号通路在CSWT治疗缺血性心衰过程中具有协同作用,且PI3K/Akt信号通路在CSWT治疗IHF发挥的作用要优于ERK1/2信号通路。