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第一部分:BMP-2多肽对钛颗粒诱导的骨溶解影响目的:骨形态发生蛋白-2(BMP-2)是目前最强的成骨诱导因子之一,但在体外不易保存容易失活。本部分研究使用BMP-2多肽是否能在钛颗粒诱导下促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞活化,从而缓解钛颗粒诱导的骨溶解。方法:(1)建立以钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解模型,并给予BMP-2多肽局部处理,术后2周,取出各实验组颅骨后进行Micro-CT分析相关参数。(2)细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)分别检测 0,0.025mg/ml,0.05mg/ml,0.1mg/ml,0.2mg/ml钛颗粒存在下人脐带间充质干细胞(UMSCs)和小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMMs)的增殖效率。(3)UMSCs在钛颗粒环境下成骨诱导7天后进行碱性磷酸酶(ALP)染色、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测成骨相关基因;成骨诱导14天后进行茜素红染色比较成骨分化影响。(4)BMMs在加入钛颗粒,巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)(30ng/ml)和NF-kB配体的受体激活剂(RANKL)(50ng/ml)破骨诱导3天后进行实时荧光定量PCR检测破骨相关基因,相同诱导5天后进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)比较破骨分化影响。结果:(1)CT三维重建可见钛颗粒组有大片骨吸收形成的陷窝,BMP-2多肽治疗组则显著减少,定量分析示骨密度(BMD)、骨体积/总体积(BV/TV)也有同样结果。(2)0.1mg/ml的钛颗粒对UMSCs和BMMs增殖效率没有影响,对细胞没有毒性,可用于后续实验。(3)与正常UMSCs相比,ALP染色和茜素红染色及量化结果表明钛颗粒存在下细胞的成骨能力减弱,qRT-PCR结果示成骨相关基因的表达在钛颗粒干预下显著下降,但BMP-2多肽能显著抑制钛颗粒造成影响。(4)TRAP染色示钛颗粒能促进破骨细胞的生成,BMP-2多肽能一定程度上抑制,qRT-PCR破骨相关基因显示出了相同的趋势。结论:BMP-2多肽能促进钛颗粒刺激下的成骨细胞分化,抑制钛颗粒刺激下破骨细胞活化,直接缓解钛颗粒诱导的骨溶解。第二部分:BMP-2多肽对经钛颗粒预处理后的间充质干细胞成骨分化的影响目的:组织中有一定数量的间充质干细胞参与组织的再生和修复,假体周围的磨损颗粒可影响该区域内的间充质干细胞活性,进而影响其成骨分化能力。本部分探究BMP-2多肽对经钛颗粒预处理一定时间后间充质干细胞的成骨分化的影响。方法:(1)流式检测正常UMSCs与经钛颗粒预处理6天后的UMSCs的细胞表型和CCK-8检测两种细胞增殖效率。(2)联合BMP-2多钛,对经钛颗粒预处理的UMSCs在成骨诱导7天后进行ALP染色、PCR检测成骨相关基因;成骨诱导14天后进行茜素红染色比较成骨分化影响。结果:(1)正常UMSCs与经钛颗粒预处理的UMSCs细胞表面标志物CD29、CD90和CD34、CD45无明显差异;CCK-8结果显示钛颗粒处理过的UMSCs比正常UMSCs增殖速度更慢。(2)与正常UMSCs细胞相比,经钛颗粒预处理的UMSCs细胞的成骨能力减弱,BMP-2多肽能显著改善这种影响。结论:钛颗粒对UMSCs细胞表面干性标志没有影响,但抑制了细胞的增殖能力和成骨分化能力,BMP-2多肽可以减轻钛颗粒引起UMSCs成骨分化能力降低。第三部分:BMP-2多肽对巨噬细胞极化的影响及其影响对成骨细胞分化的作用目的:钛颗粒被巨噬细胞吞噬后,会诱发产生一系列与骨溶解相关的细胞因子和炎性介质的释放,继而影响成骨细胞分化。本部分探究BMP-2多肽对巨噬细胞的极化影响,继而探究极化后的巨噬细胞对UMSCs成骨分化的影响。方法:(1)小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)在钛颗粒和BMP-2多肽联合诱导1天后采用实时荧光定量PCR测定极化相关基因表达,继续诱导3天后通过流式细胞术检测相关细胞表面标志物。(2)收集RAW264.7细胞培养上清,按1:2比例与成骨诱导培养基配制成条件性培养基,将UMSCs在条件性培养基成骨诱导7天后进行ALP染色、PCR检测成骨相关基因。结果:(1)流式细胞术检测示RAW264.7细胞在钛颗粒处理后细胞表面M1极化分子CD86的表达增加,M2极化分子CD206的表达减少。PCR示BMP-2多肽显著抑制致炎症基因的表达,同时促进抗炎基因的表达,促进RAW264.7向M2极化。(2)通过ALP染色以及PCR的结果显示钛颗粒条件培养基培养的UMSCs细胞成骨能力明显减弱;加入BMP-2多肽的条件培养基可促进UMSCs成骨分化。结论:BMP-2多肽促进巨噬细胞向M2极化,间接缓解钛颗粒导致的UMSCs成骨分化能力降低。