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免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是儿童最常见的出血性疾病之一，免疫介导破坏血小板和巨核细胞，致外周血血小板数目减少引起相应临床表现。由于儿童特殊的群体性，免疫力较低，对细菌、病毒的易感性，免疫性血小板减少症患儿60%-70%是急性患病，并且缓解率高，但是仍然有一部分患儿逐渐转为慢性ITP，需要间断检测血常规，持续服用激素等药物。但其机制仍然不明。高迁移率组蛋白1（High mobility group protein1）是一种非组蛋白核蛋白,HMGB1可以作为一种损伤相关的分子模式(Damage-related molecular patterns,PAMP)或警报素(Alarms)来刺激先天免疫系统或作为细胞因子复合物的一部分。HMGB1激活后，可触发核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3,NLRP3)与相应的受体结合（Tolls、RAGE等），其分子构象发生改变，诱导NLRP3分子寡聚化，逐渐与ASC蛋白结合在一起。招募半胱氨酸酶前体1(Procaspase-1)，Caspase-1将IL-1β和1L-18前体裂解为有活性的IL-1β和IL-18，调节各种免疫与炎症反应。HMGB1和NLRP3炎性小体在自身免疫性疾病和一些慢性疾病的关系已见报道。研究认为HMGB1可能与ITP的发病也有关联。本研究首先检测HMGB1与细胞因子IL-17、IL-10在慢性ITP患儿与正常对照组外周血中表达；探讨上述检测指标与临床指标的关系。随后分析慢性ITP患儿与正常对照组外周血CD14+CD16+单核细胞各亚群、CD1c树突细胞中TLR2、TLR4的表达，检测NRLP3与细胞因子IL-1β和IL-18在CD14+单核细胞、CD1c+树突细胞中的表达；培养外周血巨噬细胞，探究HMGB1与NLRP3炎性小体组分的表达关系。之后建立慢性幼鼠ITP动物模型；并研究HMGB1抑制剂的作用，探讨HMGB1在慢性ITP幼鼠动物模型中如何发挥作用。本实验共分为四部分，研究内容如下：
第一部分 慢性免疫性血小板减少症患儿血浆HMGB1水平升高与临床指标的相关研究
目的：
了解HMGB1、细胞因子IL-17、IL-10在慢性免疫性血小板减少症患儿血浆中的表达情况，HMGB1与慢性免疫性血小板减少症患儿临床资料的关系。
方法：
1.收集分析慢性免疫性血小板减少症患儿80例与正常对照组30例的临床资料。
2ELISA法检测正常对照组、慢性ITP组外周血HMGB1、IL-17、IL-10的表达。
3.分析各组间HMGB1与IL-17、IL-10及临床资料的关系。
结果：
1.慢性ITP组初诊年龄明显小于正常对照组；慢性ITP患儿皮肤黏膜出血症状较正常对照组严重，均有统计学差异（P＜0.05）。慢性ITP组患儿治疗前、后血小板数值明显低于正常对照组。慢性ITP组Th细胞比正常对照组表达比例高，其Ts细胞比正常对照组明显减少；同时Th/Ts细胞比值较正常对照组显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.慢性ITP组HMGB1、IL-17表达比正常对照组高；而IL-10在慢性ITP患儿血浆中明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
3.HMGB1与IL-17呈正相关，与IL-10呈负相关。正常对照组血浆HMGB1与IL-10呈负相关，两者有统计学差异（P＜0.05）。
4.本研究中慢性ITP组患儿血浆HMGB1与其治疗前血小板数值呈正相关，其余结果未见明显相关性。
第二部分 NLRP3炎性小体及通路相关组分在儿童慢性免疫性血小板减少症中的作用
目的：
比较慢性ITP组与正常对照组在CD14+CD16+单核细胞各亚群、CD1c+树突细胞中TLR2、TLR4的表达，以及分选CD14+单核细胞、CD1c+树突细胞后NRLP3与细胞因子L-1β和IL-18的表达。了解HMGB1在人外周血来源巨噬细胞中对NLRP3、L-1β和IL-18的刺激作用。
方法
1.用流式抗体标记正常对照组与慢性ITP组外周血，检测CD14+CD16+单核细胞各亚群、CD1c+树突细胞中TLR2、TLR4的表达。
2.用流式分选CD14+单核细胞、CD1c+树突细胞后，使用微量RNA试剂盒，利用RT-PCR检测NRLP3以及细胞因子L-1β、IL-18在单核细胞与树突细胞中的表达。
结果
1.慢性ITP患儿CD14++CD16-单核细胞阳性率降低，CD14+CD16++单核细胞阳性率升高，均有显著性差异（P＜0.05）。慢性ITP患儿CD14++CD16-、CD14+CD16++单核细胞表面TLR2阳性率较正常对照组明显降低，CD14++CD16+单核细胞表面TLR2阳性率较正常对照组明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而慢性ITP患儿单核细胞亚群中TLR4阳性率较正常对照组明显升高，差异均有显著性（P＜0.05）。两组的CD1c+树突细胞表达无明显异常，慢性ITP组CD1c+树突细胞表面TLR2的表达量阳性率降低，TLR4阳性表达率则增高，差异具有显著性（P＜0.05）。
2．慢性ITP患儿CD14+单核细胞、CD1c+树突细胞中NLRP3、IL-1β和IL-18的相对表达量都较正常对照组明显增高的差异有统计学意义（P＜0.05）。
第三部分两种不同抗血小板抗体构建慢性幼鼠ITP模型比较
目的
比较两种不同抗血小板抗体构建慢性幼鼠ITP模型的作用，选取合适的慢性幼鼠ITP模型。
方法：
1.分别用豚鼠抗小鼠血小板抗体、大鼠抗小鼠Anti-CD41抗体构建慢性幼鼠ITP模型。
2.比较两组模型的动物一般情况、血小板、生化和肝脾指数。
结果：
1.正常对照组动物模型一般情况均好于动物模型组。
2.两个ITP动物模型组血小板数值比各自对照组明显降低，但豚鼠抗小鼠血小板抗体组血小板后续上升明显。两个模型组在生化、肝脾指数无明显差异。
第四部分 HMGB1及其抑制剂在慢性幼鼠ITP模型中的机制探讨
目的：
为了验证体内实验；研究HMGB1及其抑制剂在动物模型中作用。
方法：
1.将动物模型分为正常对照组、cITP组、Anti-HMGB1组、醋酸泼尼松组、甘草甜素组检测血小板、HMGB1、IL-10、IL-17在慢性幼鼠ITP动物模型外周血中表达。
2.磁珠分选脾脏细胞中单核巨噬细胞、树突细胞，检测各组脾脏中单核巨噬细胞、树突细胞TLR2、TLR4表达，检测NLRP3、IL-1β、IL-18基因表达。
3.WB和ELISA分别检测各组幼鼠骨髓巨噬细胞NLRP3、IL-1β、IL-18的表达。
结果：
1.Anti-HMGB1中和抗体组、醋酸泼尼松组、甘草甜素组均可明显提高幼鼠模型血小板数值，差异均有显著性（P＜0.05）。cITP模型组和醋酸泼尼松组、甘草甜素组分别与正常对照组比较HMGB1蛋白表达量增加，cITP模型组、Anti-HMGB1中和抗体组、甘草甜素组均可降低幼鼠ITP模型HMGB1蛋白表达量，差异均有显著性（P＜0.05）。各个模型组与正常对照组比较IL-17蛋白表达量有所增加，差异明显（P＜0.05）；Anti-HMGB1中和抗体组、醋酸泼尼松组、甘草甜素组均可降低幼鼠ITP模型IL-17蛋白表达量，差异均有显著性（P＜0.05）。
2.各模型组CD11b+单核巨噬细胞表面TLR2、TLR4的表达量均高于对照组，cITP模型组单核巨噬细胞TLR2表达量比Anti-HMGB1中和抗体组、醋酸泼尼松组、甘草甜素组的表达量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。
3.各个模型组NLRP3、IL-1β和IL-18的表达随着rHMGB1浓度增加，表达量逐渐增加，但升高程度不一。Anti-HMGB1中和抗体组、醋酸泼尼松组、甘草甜素组均可不同程度降低ITP模型NLRP3、IL-1β和IL-18的表达。
结论：
1.在儿童慢性ITP血浆中发现HMGB1表达增高，并与细胞因子IL-17、IL-10表达相关，考虑HMGB1可作为儿童慢性ITP疾病的预警素，并与其疾病发展有关。
2.儿童慢性ITP中单核细胞和树突细胞上TLR2、TLR4表达都有改变，单核细胞、树突细胞及外周血诱导巨噬细胞中NLRP3、IL-1β和IL-18的表达增加，HMGB1可能通过NLRP3、TLR2/TLR4通路的相关组分影响儿童慢性ITP疾病的发生发展。
3.大鼠抗小鼠Anti-CD41抗体构建慢性幼鼠ITP模型能较好的维持低水平血小板，有利于慢性幼鼠ITP模型的构建。
4.Anti-HMGB1中和抗体、醋酸泼尼松、甘草甜素可能对慢性ITP的动物模型起到改善疾病状态，保护机体作用。HMGB1拮抗剂对儿童慢性ITP的保护作用为临床实验提供基础研究，是慢性ITP的治疗靶点。
第一部分 慢性免疫性血小板减少症患儿血浆HMGB1水平升高与临床指标的相关研究
目的：
了解HMGB1、细胞因子IL-17、IL-10在慢性免疫性血小板减少症患儿血浆中的表达情况，HMGB1与慢性免疫性血小板减少症患儿临床资料的关系。
方法：
1.收集分析慢性免疫性血小板减少症患儿80例与正常对照组30例的临床资料。
2ELISA法检测正常对照组、慢性ITP组外周血HMGB1、IL-17、IL-10的表达。
3.分析各组间HMGB1与IL-17、IL-10及临床资料的关系。
结果：
1.慢性ITP组初诊年龄明显小于正常对照组；慢性ITP患儿皮肤黏膜出血症状较正常对照组严重，均有统计学差异（P＜0.05）。慢性ITP组患儿治疗前、后血小板数值明显低于正常对照组。慢性ITP组Th细胞比正常对照组表达比例高，其Ts细胞比正常对照组明显减少；同时Th/Ts细胞比值较正常对照组显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.慢性ITP组HMGB1、IL-17表达比正常对照组高；而IL-10在慢性ITP患儿血浆中明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
3.HMGB1与IL-17呈正相关，与IL-10呈负相关。正常对照组血浆HMGB1与IL-10呈负相关，两者有统计学差异（P＜0.05）。
4.本研究中慢性ITP组患儿血浆HMGB1与其治疗前血小板数值呈正相关，其余结果未见明显相关性。
第二部分 NLRP3炎性小体及通路相关组分在儿童慢性免疫性血小板减少症中的作用
目的：
比较慢性ITP组与正常对照组在CD14+CD16+单核细胞各亚群、CD1c+树突细胞中TLR2、TLR4的表达，以及分选CD14+单核细胞、CD1c+树突细胞后NRLP3与细胞因子L-1β和IL-18的表达。了解HMGB1在人外周血来源巨噬细胞中对NLRP3、L-1β和IL-18的刺激作用。
方法
1.用流式抗体标记正常对照组与慢性ITP组外周血，检测CD14+CD16+单核细胞各亚群、CD1c+树突细胞中TLR2、TLR4的表达。
2.用流式分选CD14+单核细胞、CD1c+树突细胞后，使用微量RNA试剂盒，利用RT-PCR检测NRLP3以及细胞因子L-1β、IL-18在单核细胞与树突细胞中的表达。
结果
1.慢性ITP患儿CD14++CD16-单核细胞阳性率降低，CD14+CD16++单核细胞阳性率升高，均有显著性差异（P＜0.05）。慢性ITP患儿CD14++CD16-、CD14+CD16++单核细胞表面TLR2阳性率较正常对照组明显降低，CD14++CD16+单核细胞表面TLR2阳性率较正常对照组明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而慢性ITP患儿单核细胞亚群中TLR4阳性率较正常对照组明显升高，差异均有显著性（P＜0.05）。两组的CD1c+树突细胞表达无明显异常，慢性ITP组CD1c+树突细胞表面TLR2的表达量阳性率降低，TLR4阳性表达率则增高，差异具有显著性（P＜0.05）。
2．慢性ITP患儿CD14+单核细胞、CD1c+树突细胞中NLRP3、IL-1β和IL-18的相对表达量都较正常对照组明显增高的差异有统计学意义（P＜0.05）。
第三部分两种不同抗血小板抗体构建慢性幼鼠ITP模型比较
目的
比较两种不同抗血小板抗体构建慢性幼鼠ITP模型的作用，选取合适的慢性幼鼠ITP模型。
方法：
1.分别用豚鼠抗小鼠血小板抗体、大鼠抗小鼠Anti-CD41抗体构建慢性幼鼠ITP模型。
2.比较两组模型的动物一般情况、血小板、生化和肝脾指数。
结果：
1.正常对照组动物模型一般情况均好于动物模型组。
2.两个ITP动物模型组血小板数值比各自对照组明显降低，但豚鼠抗小鼠血小板抗体组血小板后续上升明显。两个模型组在生化、肝脾指数无明显差异。
第四部分 HMGB1及其抑制剂在慢性幼鼠ITP模型中的机制探讨
目的：
为了验证体内实验；研究HMGB1及其抑制剂在动物模型中作用。
方法：
1.将动物模型分为正常对照组、cITP组、Anti-HMGB1组、醋酸泼尼松组、甘草甜素组检测血小板、HMGB1、IL-10、IL-17在慢性幼鼠ITP动物模型外周血中表达。
2.磁珠分选脾脏细胞中单核巨噬细胞、树突细胞，检测各组脾脏中单核巨噬细胞、树突细胞TLR2、TLR4表达，检测NLRP3、IL-1β、IL-18基因表达。
3.WB和ELISA分别检测各组幼鼠骨髓巨噬细胞NLRP3、IL-1β、IL-18的表达。
结果：
1.Anti-HMGB1中和抗体组、醋酸泼尼松组、甘草甜素组均可明显提高幼鼠模型血小板数值，差异均有显著性（P＜0.05）。cITP模型组和醋酸泼尼松组、甘草甜素组分别与正常对照组比较HMGB1蛋白表达量增加，cITP模型组、Anti-HMGB1中和抗体组、甘草甜素组均可降低幼鼠ITP模型HMGB1蛋白表达量，差异均有显著性（P＜0.05）。各个模型组与正常对照组比较IL-17蛋白表达量有所增加，差异明显（P＜0.05）；Anti-HMGB1中和抗体组、醋酸泼尼松组、甘草甜素组均可降低幼鼠ITP模型IL-17蛋白表达量，差异均有显著性（P＜0.05）。
2.各模型组CD11b+单核巨噬细胞表面TLR2、TLR4的表达量均高于对照组，cITP模型组单核巨噬细胞TLR2表达量比Anti-HMGB1中和抗体组、醋酸泼尼松组、甘草甜素组的表达量明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。
3.各个模型组NLRP3、IL-1β和IL-18的表达随着rHMGB1浓度增加，表达量逐渐增加，但升高程度不一。Anti-HMGB1中和抗体组、醋酸泼尼松组、甘草甜素组均可不同程度降低ITP模型NLRP3、IL-1β和IL-18的表达。
结论：
1.在儿童慢性ITP血浆中发现HMGB1表达增高，并与细胞因子IL-17、IL-10表达相关，考虑HMGB1可作为儿童慢性ITP疾病的预警素，并与其疾病发展有关。
2.儿童慢性ITP中单核细胞和树突细胞上TLR2、TLR4表达都有改变，单核细胞、树突细胞及外周血诱导巨噬细胞中NLRP3、IL-1β和IL-18的表达增加，HMGB1可能通过NLRP3、TLR2/TLR4通路的相关组分影响儿童慢性ITP疾病的发生发展。
3.大鼠抗小鼠Anti-CD41抗体构建慢性幼鼠ITP模型能较好的维持低水平血小板，有利于慢性幼鼠ITP模型的构建。
4.Anti-HMGB1中和抗体、醋酸泼尼松、甘草甜素可能对慢性ITP的动物模型起到改善疾病状态，保护机体作用。HMGB1拮抗剂对儿童慢性ITP的保护作用为临床实验提供基础研究，是慢性ITP的治疗靶点。