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背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌,占原发性肝癌病理分型的90%以上;亦是临床上最常见的肝癌类型。HCC患者临床表现多样且复杂,个体差异大,早期诊断较为困难。临床诊断肝癌常用的技术方法分为实验室相关指标检测与影像学检查,而确诊肝癌的细胞学类型则需依靠病理学手段。随着科学的发展,对HCC等肿瘤的不断深入研究,潜在的小分子标志物逐渐走入研究者的视角,例如外泌体。外泌体(exosome)是一种包含了大量生物活性分子的膜性囊泡,对疾病的诊断、分期、治疗与预后都有一定的指导意义。尿液是为数不多可通过无创手段分离外泌体的临床标本,但其中大量存在的T-H蛋白是干扰外泌体分离提取的一大难点,因此亟需优化分离提取方法以获得浓度和纯度均合格的尿液外泌体。代谢组学技术可用于分析小分子代谢物,特别是脂质成分的动态变化,能够直观地体现机体生理及病理过程的整体代谢变化轨迹,对机体的健康状况、疾病的进展、诊断及治疗有着重大意义。目的:本研究旨在提供一种简便、特异的方法获取尿液中的外泌体,通过一种新型的质谱手段——电喷雾萃取电离质谱(extractive electrospray ionization mass spectrometry,EESI-MS)分析HCC、肝硬化、慢性乙型肝炎、健康对照等4组尿液中外泌体的磷脂成分,分析其具体组分变化。为HCC的早期无创诊断提供一条新的思路。方法:使用超高速离心法(200,000 g)、实验室自研方法以及外泌体提取试剂盒法提取尿液中的外泌体,Western Blot检测外泌体表面标志物比较三种方法的浓度及杂蛋白分布情况;选择最优的方法提取外泌体后,利用透射电镜(transmission electron microscope,TEM)、可调电阻脉冲传感(tunable resistive pulse sensing,TRPS)、Western Blot观测其形态、粒径及蛋白标志物浓度。利用改良Folch法提取外泌体中的脂质成分。对EESI-MS进行不同电压及萃取剂的测试,对信号峰强度、信号值广度、信号稳定性等参数进行优化,选择最合适的电压及萃取剂。利用EESI-MS对HCC、肝硬化、慢性乙型肝炎、健康对照等4组标本(实验队列每组10例,共40例,每例样本分为3份上样,共120个样本;验证队列每组20例,共80例,每例样本分为3份上样,共240个样本)进行检测,比较指纹谱图差异;利用MATLAB R2015a软件进行主成分分析(principal component analysis,PCA)并筛选出差异磷脂,利用碰撞诱导解离(collision-induced dissociation,CID)试验对目标离子进行识别和确认。利用热图进行4组磷脂的组内相关性分析,并利用ROC曲线下面积(area under curve,AUC)及约登指数判断各差异磷脂成分及组合对HCC的诊断效能。同时利用Metaboanalyst线上软件对差异磷脂进行代谢通路富集。结果:(1)Western Blot显示超高速离心法与实验室自研方法对T-H蛋白的去除均合格,试剂盒法则会残留T-H杂蛋白,且实验室自研方法分离的外泌体浓度更高;TEM、TRPS也证实了实验室自研方法分离的外泌体的存在。(2)EESI-MS检测尿液中外泌体磷脂在电压+3 kV,萃取剂为甲醇/双蒸水/冰乙酸(1/1/0.02)时信号峰值最强,m/z50~1000范围内捕捉捕捉质谱峰数目多、信号最稳定。(3)一级指纹谱图显示4组的m/z有较大差异,显示出各自疾病种类的特异性。(4)PCA结果显示4组(HCC组、肝硬化组、慢性乙型肝炎组、对照组)能独立区分开,其中HCC患者与健康对照可明显进行区分,实验队列中差异最明显的质谱峰为m/z 754,m/z 787,m/z 832和m/z 877,验证队列中差异最明显的质谱峰为m/z726、m/z787、m/z832、m/z877。(5)各差异目标离子的相对丰度在HCC组中与其他各组有明显差异(P<0.05),组间相关性分析显示HCC组与其他3组呈现负相关。(6)通过CID试验确定出差异明显的7种目标磷脂成分为[SM(d18:1/16:0)+Na]~+(m/z726),[SM(d18:0/18:1)+Na]~+(m/z754),[PC(16:0/16:0)+Na]~+(m/z757),[PC(18:1/18:1)+H]~+(m/z787),[PG(18:0/20:3)+H]~+(m/z803),[PC(18:0/20:4)+Na]~+(m/z832),[PC(20:4/20:0)+K]~+(m/z877)其中2种为神经鞘磷脂,4种为磷脂酰胆碱及1种为磷脂酰甘油。(7)实验队列中m/z726、m/z754、m/z757、m/z787、m/z803、m/z832、m/z877的曲线下面积(AUC)分别为0.852,0.873,0.778,0.884,0.708,0.817,0.751,验证队列中的m/z726、m/z754、m/z757、m/z787、m/z803、m/z832、m/z877的曲线下面积(AUC)分别为0.818,0.741,0.780,0.890,0.715,0.821,0.820。7种磷脂成分联合诊断的AUC分别为0.989(实验队列),0.985(验证队列)。(8)差异磷脂参与了5条代谢通路,分别为鞘磷脂代谢、甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢及α-亚麻酸代谢等通路。结论:肝细胞癌患者尿液外泌体磷脂的EESI-MS检测重复性好且快速、高效;可能为临床疾病的无创、无辐射检测提供了一种新思路。