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研究背景高血压是目前全世界发病率最高的疾病之一,也是成人过早死亡的首位原因。世界上每年有760万人死于高血压,有9400万人因高血压致残。中国高血压最新调查数据显示,我国2012-2015年成人高血压粗患病率为27.9%,我国71%的脑卒中和54%的心梗死亡与高血压有关。循证医学表明降低血压可明显减少心血管事件的发生。虽然人们对高血压的研究取得了斐然成绩,但高血压病因仍不尽明了,明确高血压的发生机理对于高血压的防治具有重要意义。高血压发病机制纷繁复杂,涉及包括中枢神经、心脏、肾脏和血管在内的多种组织器官。尽管其机制不明,但肾脏的尿钠排泄功能在其中的作用得到人们的重视。肾脏是机体调节水钠代谢的主要器官,尿钠排泄与机体血压水平密切相关。生理条件下钠盐排出量和摄入量几乎相等,称为“钠平衡”,这是机体维持内环境稳定、保证血压平稳的重要机制。肾脏钠重吸收增加导致尿钠排泄减少,进而引起机体钠水潴留和血压升高。而近曲小管则是尿钠重吸收最重要部位,其对钠的重吸收约占了肾脏重吸收尿钠的65-70%,因此,对于肾脏近曲小管尿钠重吸收抑制能力研究成为高血压研究的重要方向之一。近年来,作为调控物质转运的重要物质,细胞内物流蛋白的作用受到重视。如:在肾脏集合管上皮细胞,物流分子SNAREs、SNAP-23协助将H+-ATP酶靶向转运至顶端膜完成H+跨膜转运;囊泡转运也是甲状旁腺激素诱导仓鼠肾细胞Na+,K+-ATP酶内吞的方式。肾脏近端小管（renal proximal tubule,RPT）是Na+重吸收的主要部位,为了探寻物流系统在其中的作用及机制,我们用RNA芯片对比分析了WKY大鼠与SHR大鼠肾组织物流分子RNA的差异表达,筛选出一种物流分子GS28,我们推测该分子可能在高血压的发病中起着重要的作用,肥胖和高血压密切相关,大约78%的男性高血压患者和65%的女性高血压患者病因直接与肥胖相关,个体收缩压和舒张压与体重指数或腰围呈正相关,减轻体重后多数肥胖性高血压患者血压可下降。广泛分布于人体的脂肪细胞,不但能够储存能量,而且具有内分泌的功能,通过分泌多种脂肪因子与中枢神经系统、免疫系统及其它内分泌器官保持密切的联系。其中脂联素的作用受到人们的关注。本课题组前期的研究发现,脂联素受体在RPT细胞上表达丰富,同时,肾动脉灌注脂联素对WKY大鼠的尿钠排泄具有明显的促进作用,但在SHR大鼠中这种利尿利钠作用却明显受损。进一步的研究发现高血压大鼠对脂联素敏感性的下降,是由于SHR大鼠中Adipo R1的过度磷酸化造成的。但Adipo R1具体的磷酸化位点尚不明确,Adipo R1的过度磷酸化是由什么原因造成的也不明确。研究目的1.明确GS28在高血压状态的肾脏是否异常表达。2.明确GS28在肾脏的异常表达是否跟血压升高相关。3.GS28对血压的影响的机制研究。4.Adipo R1磷酸化位点的研究。5.进一步明确GRK4在Adipo R1磷酸化中的关键作用。研究内容和方法1.明确GS28在高血压状态的肾脏是否异常表达。（1）通过肾脏基因芯片结果筛选SHR与WKY差异表达的物流分子,继而通过RT-PCR的方法确定差异表达的物流分子;（2）利用RT-PCR和WB的方法,确认在SHR的RPT细胞中,GS28表达上调;（3）用WB的方法在人类高血压/正常人群的RPT细胞系中进一步确认GS28的异常表达。2、明确GS28在肾脏的异常表达是否跟血压升高相关。（1）利用超声微泡的方法在肾脏敲降GS28,用尾套法监测大鼠血压变化,用代谢笼监测尿量、尿钠的变化;（2）用si-GS28干扰WKY和SHR的RPT细胞,观察钠钾ATP酶活性变化。3、GS28对血压的影响的机制研究。（1）用蛋白质谱、免疫共沉淀、激光共聚焦等方法筛选跟GS28有直接连结的蛋白。（2）用si-GS28干扰RPT细胞后,采用免疫印迹、免疫荧光、免疫组化等方法观察钠钾ATP酶在胞内的分布变化。（3）用免疫印迹的方法检测si GS28干扰RPT细胞后,NKAα1的磷酸化水平变化。4、Adipo R1磷酸化位点的研究。（1）通过生物信息学预测Adipo R1的磷酸化位点,制备突变体质粒;（2）利用RT-PCR和免疫印迹的方法,验证质粒转染效率;（3）用免疫共沉淀的方法观察野生型和突变体质粒转然后Adipo R1的磷酸化变化、Adipo R1与Gαi的结合变化;（4）用野生型或突变体质粒转染SHR的RPT细胞,再给与脂联素干预并测定钠钾ATP酶活性,观察其对脂联素敏感性的变化。5、进一步明确GRK4在Adipo R1磷酸化中的关键作用。（1）用超声微泡的方式携载si RNA靶向敲降SHR肾脏的GRK4的表达,用RT-PCR和免疫印迹的方法观察敲降效率;（2）用免疫共沉淀的方法验证GRK4敲降后Adipo R1的磷酸化变化和Adipo R1与Gαi结合能力的变化;（3）用单肾灌注的方法,观察GRK4肾脏局部敲降的SHR大鼠对脂联素的敏感性变化。实验结果:1、SHR大鼠肾皮质中GS28在转录水平和蛋白水平,较同周龄的WKY大鼠均有显著的升高;2、高血压人肾小管上皮细胞株中GS28蛋白水平较正常人肾小管上皮细胞株显著升高;3、在SHR大鼠肾脏局部敲降GS28的表达后,SHR出现尿钠排泄增加、血压下降,提示GS28在SHR高血压的发生过程中起着重要的作用;4、用si-GS28干扰RPT细胞后,其Na+-K+-ATPase活性显著下降。提示GS28通过影响Na+-K+-ATPase活性而影响水钠的重吸收,最终影响血压。5、GS28与NKAα1有直接连接,提示GS28对钠泵活性的调节可能是直接调控。6、GS28被敲降后NKAα1从胞膜转位到胞浆,提示GS28可以影响NKAα1的细胞内分布。7、GS28可以影响NKAα1的磷酸化,从而影响其细胞内的分布。8、Adipo R1N端的Ser7、Thr24、Thr43这三个氨基酸残基被突变为Ala后,Adipo R1在丝氨酸和苏氨酸残基的总磷酸化水平下降,Adipo R1与Gαi的结合增加。9、突变体Adipo R1质粒转入SHR的RPT细胞后,SHR的RPT细胞对脂联素的敏感性恢复。10、GRK4在SHR大鼠肾脏被靶向敲降后,SHR大鼠血压下降、尿量尿钠排泄增多;11、GRK4在SHR大鼠肾脏被靶向敲降后,Adipo R1的磷酸化水平显著下降,同时Adipo R1与Gαi的结合显著减少;12、SHR大鼠肾脏中GRK4被敲降后,对脂联素的敏感性显著改善。实验结论:1、高血压大鼠肾小管上皮细胞中GS28的表达异常升高,可通过增加钠钾ATP酶的活性而影响血压;2、GS28通过影响NKAα1的磷酸化来调控其在细胞内的分布,进而影响钠钾ATP酶的活性;3、SHR的RPT细胞中Adipo R1的过度磷酸化导致其对脂联素的敏感性降低,Adipo R1N端的Ser7、Thr24、Thr43这三个氨基酸残基是关键的磷酸化位点;4、SHR的RPT细胞中Adipo R1的过度磷酸化是由GRK4介导的,靶向敲低GRK4可改善SHR对脂联素的敏感性。