目的对低温冻存异体软骨种子细胞构建的工程化软骨用于修复兔膝关节缺损进行大体和组织形态学观察。从而探讨低温冻存异体软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞修复关节软骨缺损的可行性及效果,为临床应用提供理论依据。方法体外实验:取用慢速梯度降温法保存的健康成年新西兰兔双膝关节软骨原代种子细胞, 37℃水浴中复温2分钟。取一定量的经滤膜除菌的海藻酸纳混悬液加入精确计数的软骨种子细胞,充分吹打混匀,种植密度为4×107/m1,然后在硅胶盘模上制备细胞盘,加入质量分数为1.06%的Cacl2液凝胶化10min,DMEM/F12无血清培养基加20%胎牛血清于24孔培养板中培养2周。分别于1、2、4、6、8、10、12、14天分别取3个完整的细胞盘,取均数绘制软骨细胞的生长曲线。于培养2周取材,切片行HE染色,观察软骨细胞的分布、形态。体内实验:同时选用成年新西兰大白兔27只,用电钻在股骨的髌股关节面中心造成直径3.0mm,深3.0mm的全层软骨缺损模型,随机在缺损处植入体外培养2周的软骨细胞-海藻酸钠盘(A组)及无细胞的海藻酸钠载体(B组),空白组不做处理(C组)。分别于术后4、8、12周采用空气栓塞法分批处死动物后取材,行大体观察,HE、甲苯胺蓝染色及免疫组织化学分析观察。进行Wakitani组织学评分,观察在体内关节软骨缺损修复效果。数据以均数±标准差(x±s)表示,用SAS8.1统计软件包进行分析,采用双因素方差分析进行实验效应和时间效应的分析,并用LSD-t检验进行组间多重比较,P<0.05为有统计学意义。结果1.软骨细胞盘内软骨细胞的观察与检测:软骨种子细胞在海藻酸钠支架内,于培养4天后开始增殖,2周时继续增量生长,并形成工程化软骨。2.移植处大体观察:术后三组观察,关节内滑膜均无充血、水肿,无关节液的异常,关节囊无粘连。术后12周时,A组修复缺损组织与周围正常软骨组织很难区分,与周围正常组织无明显界限,颜色接近,表面光滑,色泽一致,按压弹性一致。其余两组均可见缺损处未完全修复,有凹陷,按压略有弹性,低于周围软骨组织,未见软骨组织,与周围组织有明显差别。3.移植处组织学观察:术后12周时,A组以透明软骨修复为主。免疫组化示软骨细胞呈阳性,甲苯胺蓝染色示软骨组织胶原基质的合成与分泌功能旺盛。缺损部位修复面基本平整,修复组织和周围软骨整合紧密,基本无差异。整个观察期,未见血管及淋巴侵入。其余两组缺损区以纤维组织填充为主,略有凹陷,未能完全修复。甲苯胺蓝染色及免疫组化,B组之见少量软骨细胞表达,C组未见软骨细胞表达,细胞外基质与Ⅱ型胶原未见表达。4. Wakitani组织学评分及统计学分析,示A组与其余两组的修复效果有显著性差异(P<0.05)。结论1.通过慢速梯度降温法保存的软骨细胞可以作为软骨组织工程的种子细胞。2.海藻酸钠是一种比较理想的支架材料,软骨细胞-海藻酸钠复合物体在外培养可生成工程化软骨;3.用此复合物构建的工程化软骨可以修复兔膝关节缺损。