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研究背景 自1976年应用BCG灌注治疗膀胱癌,经过38年的大量临床实践和长期的随访研究结果证实,BCG灌注已成为预防浅表膀胱肿瘤术后复发和治疗膀胱原位癌国际公认的一线药物,但BCG抗肿瘤免疫作用的确切机制尚未完全阐明。已发现,中性粒细胞(PMN)在BCG诱导局部细胞免疫中作为起始效应细胞募集单个核细胞侵入和活化,并且BCG可以诱导其分泌TRAIL直接杀伤肿瘤。中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps,NETs)是近年发现有别于凋亡和坏死的第三种死亡途径,对肺泡上皮细胞及血管内皮细胞具有细胞毒及促凋亡作用,并在自体免疫性疾病中具有免疫调节作用。我们前期首次发现BCG可刺激NETs形成。那么在PMN消亡过程中NETs的形成在BCG抗肿瘤免疫中有何作用?基于以上问题,本课题重点研究了肿瘤细胞对BCG诱导NETs形成的影响;NETs对膀胱肿瘤细胞的效应及其对单个核细胞细胞因子表达的影响,探讨NETs在BCG介导的抗肿瘤免疫效应中的相关作用机制。第一部分:BCG诱导中性粒细胞捕获网的形成及肿瘤细胞对其形成的影响目的:探讨BCG诱导NETs形成及肿瘤细胞在其形成过程的作用。方法:BCG与人PMN体外共育,免疫荧光染色后,激光共聚焦荧光显微镜观察NETs的形成并判定构成NETs的主要组份,并应用MicroBCA法对NETs的总蛋白进行定量分析;BCG预处理的肿瘤细胞与PMN共培养,镜下观察并通过Image J软件进行图像处理分析,对比BCG未处理组的NETs形成;BCG和肿瘤细胞共培养的上清与PMN共育,与单独BCG和单独肿瘤细胞培养上清处理组对比NETs形成,同时ELISA法检测BCG与肿瘤细胞共育上清液中IL-8的表达水平。结果:1.BCG与PMN共育2h后镜下可见NETs形成;免疫荧光染色显示,NETs的主要成分为DNA、组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶。2.BCG预处理的肿瘤细胞和未处理的肿瘤细胞相比,诱导PMN形成NETs率统计学差别显著(P<0.01)。3.BCG和T24细胞共育2h的上清液可以诱导NETs形成,形成率与单独BCG和单独肿瘤细胞上清液组比统计学差异显著(P<0.01)。4.BCG与T24细胞共育较对照组,上清液IL-8的表达水平明显增加,在BCG同一浓度,不同时间(15min、30min、60min、120min、240min、480min)其 IL-8表达水平2h达高峰,继续共育4h、8h后其IL-8表达水平呈逐渐降低。第二部分NETs对膀胱癌T24细胞效应及PBMC细胞因子表达的影响目的:探讨NETs对膀胱癌T24细胞增殖抑制、凋亡的影响、凋亡蛋白表达及NETs对PBMC细胞因子表达水平的影响。方法:5×106 CFU/mL BCG与中性粒细胞(MOI=10:1)共育4h诱导NETs形成,制备成无细胞悬液;取不同浓度NETs悬液与T24细胞共育,通过CCK-8、LDH释放法、流式细胞术、western blot技术分析NETs对T24细胞的增殖抑制、直接细胞毒作用、凋亡效应及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达变化;ELISA法检测NETs与PBMC共育后上清中IL-2和TNF-α的表达水平。结果:1.NETs实验组与对照组比能显著抑制T24细胞的增殖,统计学意义差别显著(P<0.05)。在一定浓度和时间范围内NETs对T24细胞的增殖抑制作用呈时间-效应关系和浓度-效应关系。2.LDH释放实验的结果显示,NETs与T24细胞共育后,LDH释放量明显增高,细胞毒作用显著,随NETs浓度增加LDH释放量呈递增,统计学意义差别显著(P<0.05)。3.NETs处理的T24细胞与对照组相比,通过流式细胞计数,共育24h后细胞凋亡率明显增高(1 × NETs 7.88±1.7%,2×NETs 8.1±3.1%,对照组1.78±0.8%),差别显著(P<0.01)。4.Western blot结果显示,NETs与T24细胞共育24h后与处理组相比,Bax表达增强,Bcl-2表达减弱。5.NETs与PBMC共育在不同时间组(24h、48h、72h、96h)较对照组的IL-2、TNF-α表达水平有统计学差异(P<0.05)。结论:1.BCG可诱导中性粒细胞形成NETs;肿瘤细胞有助于BCG诱导的NETs形成,与BCG促进肿瘤细胞分泌IL-8有关,后者为已明确的NETs诱导因子之一。2.BCG诱生的NETs在体外对膀胱癌细胞有细胞毒作用并能抑制其增殖和诱导凋亡;促凋亡作用与Bcl-2降低,Bax增强有关。3.NETs可以促进单个核细胞Th1型细胞因子的表达上调,发挥免疫调节实现抗肿瘤作用。4.实验结果表明,BCG作用下PMN通过NETosis等方式而消退,NETs的形成在BCG抗膀胱肿瘤免疫中可能起着重要的调节效应。这对膀胱灌注BCG传统的DTH免疫效应理论提出了新的认识,并为BCG免疫应答的初始效应细胞—中性粒细胞介导的BCG抗肿瘤免疫机制提供了科学依据。