胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,约占所有颅内原发肿瘤的一半,是我国颅内肿瘤发病率最高的肿瘤。其侵袭性强,复发率高,即使对胶质瘤患者采用手术切除联合术后放化疗的综合治疗,五年存活率只有10%左右,严重威胁人类健康。miRNA已被发现在生物细胞代谢、凋亡、生长和增殖等病理和生物学过程中发挥重要作用。在不同种类的肿瘤中发现了异常的miRNA表达,它们通过直接调控靶基因发挥肿瘤抑制功能或致癌作用。但目前miRNA-424在胶质瘤细胞侵袭、迁移和上皮间质转化中的机制尚不清楚。我们选取miRNA-424作为研究对象,目的在于研究miRNA-424抑制胶质瘤细胞侵袭迁移和上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）的可能的内在机制,寻找并验证miRNA-424下游靶点,为寻找新的靶点治疗方法提供依据。KIF23是驱动蛋白家族的一员,定位于核内。其对肿瘤侵袭能力密切相关,有研究表明KIF23可能激活Akt信号通路促进肝细胞癌增殖、侵袭,胶质瘤细胞增殖。但是,KIF23与miR-424之间的关系,以及KIF23与胶质瘤患者预后的关系目前不清楚。我们将通过实时定量PCR检测比较KIF23基因在胶质瘤组织和正常脑组织、胶质瘤细胞系和人星形细胞系之间表达差异;通过实时定量PCR、Western blot试验验证KIF23在miR-424mimcs组、miR-4245 inhibitors组分别相较各自NC组之间mRNA和蛋白水平变化情况,再通过双萤光素酶报告基因试验验证KIF23是miR-424的下游靶点,我们因此猜测KIF23与胶质瘤的发生发展可能相关,miR-424对胶质瘤的作用可能是通过靶向调控KIF23引起的。通过Kaplan-Meier分析KIF23基因表达差异与患者生存时间的关系,验证KIF23与患者预后的关系。本研究从临床水平、体外细胞水平和体内动物水平上探讨了miR-424在胶质瘤中的生物学性质,其在miR-424的胶质瘤细胞侵袭迁移、EMT调控中发挥了重要作用,也为以后更深入地研究miR-424的功能提供了重要的线索。第一部分miR-424抑制胶质瘤细胞上皮间质转化和侵袭迁移目的明确miR-424在神经胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中的表达情况,及其与病人预后相关性,寻找新的胶质瘤可能的标志物;研究miR-424表达量与胶质瘤侵袭迁移和EMT过程的关系。方法1.组织标本:选取2015年5月至2017年4月在日照市人民医院诊断为胶质瘤的患者54例,经过颅内肿瘤切除术,共收集54例胶质瘤患者的胶质瘤组织标本。患者的组织病理学诊断均根据修订的国际肿瘤分级进行。同期,选取适当的（经影像学证实体内无肿瘤）外伤性脑损伤手术患者,获得12例非肿瘤、正常脑组织做为对照组。所有患者术前均未接受放疗或化疗,并提供书面知情同意书,本研究经日照市人民医院伦理委员会批准。2.细胞系:人神经胶质瘤细胞系（A172,SHG-44,T98,LN18和LN229）和正常人星形胶质细胞（normal human astrocytes,NHA）购买自美国ATCC细胞库。3.细胞培养:将冻存的细胞经过复苏、传代后,培养在37℃、5%二氧化碳,饱和湿度细胞培养箱中。4.提取RNA及实时定量RT-PCR:采用Trizol法提取RNA。将胶质瘤组织与正常脑组织相比较,胶质瘤细胞系与正常星形细胞系相比较,采用实时定量RT-PCR检测miR-424分别在其中的表达差异。5.培养LN229和A172细胞系用于体外细胞功能学试验。本试验用胶质瘤细胞系中,miR-424表达量在LN229细胞系中最低,A172细胞系最高。将miR-424 mimics及其阴性对照转染入LN229,miR-424 inhibitor及其阴性对照转染入A172。6.稳定转染后,我们通过Transwell法研究了上调和下调miR-424表达量对胶质瘤细胞侵袭迁移能力的影响。7.稳定转染后,分别采用荧光定量PCR和Western blot试验分别检测miR-424高表达和低表达时EMT标志物mRNA和蛋白水平相应变化,研究miR-424表达量对胶质瘤细胞发生EMT的影响。8.分析miR-424在神经胶质瘤患者中的临床意义:采用t检验将胶质瘤患者不同WHO分级、术前KPS评分等级、性别、年龄和肿瘤体积与miR-424表达水平比较。Kaplan–Meier分析法估计中位生存时间和总生存率,用Log-rank检验单因素分析miR-424表达与胶质瘤患者总体生存率的关系。结果1.与正常脑组织标本相比,miR-424在胶质瘤组织标本中明显下调,差别有显著统计学意义（P<0.01）。在A172、SHG-44、T98、LN229和LN18细胞系中miR-424的表达较正常细胞系NHA表达明显下降,差别均有显著统计学意义（P<0.05）2.通过Transwell试验,稳定转染miR-424拟物后,miR-424在LN229细胞中高表达,细胞的侵袭和迁移能力受抑制（P<0.05）;稳定转染miR-424抑制物后,miR-424在A172细胞低表达,细胞的侵袭和迁移能力提高（P<0.01）。3.经过荧光定量PCR检测,在LN229细胞系转染miR-424拟物后,与阴性对照组相比,miR-424拟似物组中的E-cadherin的mRNA表达水平升高,差别有统计学意义（P<0.05）,N-cadherin和Vimentin的mRNA表达水平降低,差别有统计学意义（P<0.05）;在A172细胞系转染miR-424抑制物后,与阴性对照组相比,miR-424抑制物组中的E-cadherin的mRNA表达水平降低,差别有统计学意义（P<0.05）,N-cadherin和Vimentin的mRNA表达水平升高,差别有统计学意义（P<0.05）。4.经过Western blot试验,miR-424高表达LN229细胞中E-cadherin蛋白水平明显增加,而N-cadherin和vimentin蛋白水平明显减少;此外,在A172细胞中,miR-424低表达显著降低了E-cadherin的蛋白水平,增高了N-cadherin和vimentin的蛋白水平。5.按照α=0.05检验水准,高、低miR-424的表达水平与不同WHO分级（P=0.0065）和术前KPS评分等级（P=0.0171）组间比较有统计学差异。胶质瘤患者性别、年龄和肿瘤体积与miR-424表达水平无明显统计学差异。Kaplan–Meier分析法估计中位生存时间和总生存率,经Log-rank检验单因素分析显示,miR-424低表达的胶质瘤患者总体生存率明显降低。结论1.与正常脑组织标本相比,miR-424在胶质瘤组织标本中明显下调;与正常人类星形胶质细胞系对比,miR-424在胶质母细胞瘤细胞系中的相对表达水平明显下调,差异有统计学意义。推测其在胶质瘤的发生发展中可能有早期诊断价值。2.miR-424可以负性调控胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。3.miR-424是胶质瘤EMT过程的抑制因子,EMT可能是miR-424调节胶质细胞瘤细胞的侵袭和迁移的潜在机制。4.miR-424低表达的胶质瘤患者总体生存率明显降低,与高WHO分级和低术前KPS评分等级相关,差异有统计学意义;miR-424表达水平可能是影响患者预后的因素之一。第二部分KIF23为miR-424的直接作用靶点,其表达水平与病人预后负相关目的明确KIF23在神经胶质瘤组织和细胞系中的表达情况,及其与病人预后相关性,寻找新的胶质瘤可能的标志物;验证了KIF23是miR-424在胶质瘤细胞中的直接靶点。验证在动物体内miR-424高表达与胶质瘤生长速度的关系。方法1.组织标本:选取2015年5月至2017年4月在日照市人民医院诊断为胶质瘤的患者54例,经过颅内肿瘤切除术,共收集54例胶质瘤患者的胶质瘤组织标本。患者的组织病理学诊断均根据修订的国际肿瘤分级进行。同期,选取适当的（经影像学证实体内无肿瘤）外伤性脑损伤手术患者,获得12例非肿瘤、正常脑组织做为对照组。所有患者术前均未接受放疗或化疗,并提供书面知情同意书,本研究经日照市人民医院伦理委员会批准。2.细胞系:人神经胶质瘤细胞系（A172,SHG-44,T98,LN18和LN229）和正常人星形胶质细胞（normal human astrocytes,NHA）购买自美国ATCC细胞库。3.细胞培养:将冻存的细胞经过复苏、传代后,培养在37℃、5%二氧化碳,饱和湿度细胞培养箱中。4.提取RNA及实时定量RT-PCR:采用Trizol法提取RNA。将胶质瘤组织与正常脑组织相比较,胶质瘤细胞系与正常星形细胞系相比较,采用实时定量RT-PCR检测KIF23分别在其中的表达差异。5.培养LN229和A172细胞系,将miR-424 mimics及其阴性对照转染入LN229,miR-424 inhibitor及其阴性对照转染入A172。6.稳定转染后,分别采用荧光定量PCR和Western blot试验分别检测KIF23基因的mRNA和蛋白水平相应变化,研究miR-424表达量对KIF23的影响。7.采用生物信息学方法预测miRNA-424可能的下游靶点,研究KIF23在胶质瘤与正常脑组织的表达差异,并预测其临床意义。8.双萤光素酶报告基因试验验证miR424的直接靶基因。9.采用Kaplan-Meier分析KIF23表达与胶质瘤患者的总生存率的关系。10.裸鼠成瘤实验验证miRNA-424高表达与胶质瘤生长速度之间的关系。结果1.生物信息学研究:在Targetscan数据库和microRNA网站中检索miR-424可能的靶基因,在所有候选基因中KIF23是靶基因可能性较大。检索Oncomine数据库,KIF23在胶质瘤中比在与正常脑组织中的表达增高。检索Oncolnc数据库,预测KIF23表达水平不同的胶质瘤患者的总生存时间有显著差异。采用两组间Log-rank单因素分析后,KIF23高表达组胶质瘤患者比低表达组患者的总生存时间显著降低。2.实时定量PCR方法检测:与正常脑组织标本相比,KIF23在胶质瘤组织标本中明显上调,差别有显著统计学意义（P<0.01）。与正常星形胶质细胞系对比,在A172、SHG-44、T98、LN229和LN18细胞系中KIF23的表达较正常星形细胞系表达明显增高,差别有显著统计学意义（P<0.05）。3.荧光定量PCR检验分析显示这两个转染后细胞系LN229、A172中KIF23基因mRNA分别表达下降和表达增高,差别均有显著统计学意义（P<0.05）。Western blot试验验证KIF23在转染后胶质瘤细胞系LN229、A172中KIF23蛋白水平分别下降和升高。4.双萤光素酶报告基因试验验证:KIF23为miR424直接作用的靶基因,而且miR-424可以通过直接靶向结合KIF23-3’-UTR影响KIF23的表达。5.经Kaplan-Meier分析表明,KIF23表达量与胶质瘤患者预后相关,表达高的胶质瘤患者的总生存率小于KIF23表达低的胶质瘤患者。6.裸鼠异体成瘤试验:在胶质瘤中的miR-424高表达可以明显抑制肿瘤生长。结论1.KIF23是miR-424的下游直接靶点。miR-424可能以KIF23为直接靶点抑制胶质瘤细胞的侵袭迁移和EMT。2.KIF23表达量与胶质瘤患者预后相关,表达高的胶质瘤患者的总生存率小于KIF23表达低的胶质瘤患者。3.体内试验中,胶质瘤中的miR-424高表达可以明显抑制肿瘤生长。以miR-424为靶点的分子治疗抑制EMT可能成为今后治疗胶质瘤的策略。