本研究利用乳腺癌细胞模型分析了CUL4B在乳腺癌细胞EMT进程中的作用及其分子机制。　　第一部分 CUL4B促进乳腺癌细胞EMT进程　　本实验室前期实验结果表明CUL4B在乳腺癌中高表达。为明确CUL4B在乳腺癌细胞迁移及侵袭中的作用，本部分我们首先分析了CUL4B在乳腺癌细胞EMT进程中的作用，取得了如下结果:　　1.CUL4B表达水平与乳腺癌细胞EMT程度呈正相关:我们应用CellminerNCI60 analysis Tools数据库分析了6种乳腺癌细胞系中CUL4B基因及EMT相关标记物及转录因子的表达情况，同时用Western blotting方法在蛋白水平进行验证，结果表明CUL4B的mRNA和蛋白表达水平与乳腺癌细胞侵袭能力及间质细胞标志物及EMT转录因子（TWIST1，ZEB1，ZEB2，FOXC2，CDH2等）表达水平呈正相关，而与上皮细胞标志物(CDH1，KRT19等)表达水平呈负相关，提示CUL4B可能促进乳腺癌细胞EMT进程。　　2.过表达CUL4B增加正常乳腺上皮细胞EMT促进因子表达，抑制CDH1表达:利用慢病毒表达系统，我们构建了过表达CUL4B的正常乳腺上皮细胞MCF10A及对照稳筛细胞株(MCF10A CUL4B和MCF10A Con)，实时定量PCR和Western blotting方法检测CUL4B过表达对EMT相关标志物表达水平的影响。结果显示在MCF10A细胞中过表达CUL4B导致上皮细胞标志物CDH1表达下降，EMT转录因子Snail和ZEB1表达升高，说明CUL4B发挥调控EMT作用。　　3.CUL4B促进乳腺癌细胞EMT进程:为进一步证实CUL4B促进EMT进程的作用，我们利用转移能力较低的乳腺癌细胞系MCF7构建了CUL4B过表达及对照稳筛细胞株(MCF7 CUL4B和MCF7 Con)和转移能力较高的乳腺癌细胞系MDA-MB-231构建CUL4B低表达及对照稳筛细胞株(MDA-MB-231shCUL4B和MDA-MB-231 shNC)。Western blotting方法和实时定量PCR检测改变CUL4B表达水平对乳腺癌细胞EMT相关标志物和转录因子表达水平的影响。结果发现，过表达CUL4B显著降低上皮细胞标志物E-cadherin表达，显著增加间质细胞标志物（如CDH2，VIM）和EMT转录因子（如Snail）表达水平;而干扰CUL4B表达，显著增加E-cadherin表达、降低VIM和Snail等表达水平，进一步证实CUL4B具有促进EMT进程作用。　　4.CUL4B促进乳腺癌细胞迁移与侵袭:由于EMT是肿瘤转移的重要机制，我们用Transwell和Matrigel分析方法检测了干扰CUL4B表达对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响。发现干扰CUL4B表达显著降低乳腺癌细胞迁移与侵袭能力。　　5.CUL4B促进乳腺癌细胞获得肿瘤干细胞特征:EMT被认为是肿瘤细胞获得干细胞特征的重要机制之一，为此我们利用微球体和流式细胞术分析了改变CUL4B表达对乳腺癌细胞获得干细胞特征的影响。发现干扰CUL4B表达显著降低MDA-MB-231细胞微球体形成能力;流式细胞术分析显示过表达CUL4B增加MCF7细胞中CD44HighCD24Low的细胞群比例;而干扰CUL4B表达显著降低MDA-MB-231细胞中CD44HighCD24Low的细胞群比例。表明CUL4B可能促进乳腺癌细胞的肿瘤干细胞形成能力。　　以上研究结果显示，CUL4B具有促进EMT进程作用。　　第二部分 CUL4B促进乳腺癌细胞EMT进程的分子机制研究　　上部分研究发现CUL4B促进乳腺癌细胞EMT进程，增强乳腺癌细胞迁移与侵袭能力。本部分我们分析了CUL4B促进乳腺癌细胞EMT进程的分子机制，取得了如下结果:　　1.CUL4B抑制CDH1表达:上皮细胞标志物E-cadherin表达降低或不表达是EMT的显著特征。因此，我们首先分析了改变CUL4B表达对MCF7细胞CDH1表达水平的影响，发现CUL4B负调控CDH1表达。　　2.CRL4B协同Snail/HDAC抑制CDH1表达:编码E-cadherin的基因CDH1表达受Snail等转录因子调控，而且前期研究结果表明CRL4B可以协同PRC2、HDAC、DNMT复合物等转录抑制复合物发挥转录抑制作用。那么，CRL4B调控CDH1表达是否是通过Snail介导的呢？为此，我们首先采用免疫共沉淀方法分析了CRL4B与Snail蛋白之间是否存在相互作用。结果显示，Snail与CRL4B复合物组份CUL4B和DDB1之间存在明显相互作用，提示它们可以协同作用共同调控CDH1表达。Snail作为转录抑制因子抑制CDH1表达，而Snail发挥转录抑制作用通常是通过招募PRC2、HDAC等转录抑制复合物实现;我们的前期研究结果显示，CRL4B可以协同PRC2、HDAC、DNMT等转录抑制复合物发挥作用。为了明确哪个（些）转录抑制复合物参与CRL4B介导的CDH1转录抑制，我们分别用5-aza(DNMT抑制剂)、DZNep(EZH2抑制剂)和TSA(HDAC抑制剂)处理过表达CUL4B的MCF7细胞株进行拯救实验。结果发现，HDAC抑制剂TSA处理能明显恢复由于过表达CUL4B引起的CDH1表达水平下降，提示CRL4B复合物主要通过协同HDAC复合物抑制CDH1的表达。进一步用免疫共沉淀方法检测乳腺癌细胞系中CRL4B与HDAC家族成员结合情况，发现CRL4B与HDAC1和HDAC3存在相互结合。染色质免疫共沉淀(ChIP)分析证实CUL4B、DDBl和Snail结合于CDH1启动子上相同位点。　　3.CUL4B促进CDH1启动子区域H2AK119单泛素化和组蛋白去乙酰化:为了进一步明确CUL4B对CDH1的调控作用，我们采用定量ChIP实验检测了干扰CUL4B表达对CDH1启动子区域结合蛋白和组蛋白修饰的影响。发现，干扰CUL4B表达不仅明显减少CUL4B、DDB1在CDH1启动子区域的结合，而且明显减少该区域H2AK119ub1和H3K27me3的富集水平、增加乙酰化组蛋白水平。进一步说明CRL4B协同去乙酰化复合物HDAC在转录水平抑制CDH1的表达。　　4.Snail可能发挥招募CRL4B复合物到CDH1启动子区域的作用:尽管多项研究显示CRL4B在转录调控中发挥重要作用，但CRL4B并不具有DNA结合结构域，那么，CRL4B是否是通过Snail招募到CDH1启动子上呢？为此，我们在MDA-MB-231细胞中转染Snail特异的siRNA及对照siNC，采用定量ChIP实验检测CRL4B在CDH1启动子上的结合情况，结果表明在MDA-MB-231细胞中干扰Snail表达后，显著降低了CRL4B在CDH1启动子区域的结合。相反，在Snail过表达的细胞中，Snail促进了CRL4B在CDH1启动子上的结合。以上结果提示Snail介导了CRL4B在CDH1启动子区域的结合。　　5.CUL4B通过抑制miRNA-34正向调控Snail表达:我们的分析发现过表达或干扰CUL4B不仅影响CDH1表达，而且影响Snail表达水平，提示CRL4B复合物除协同Snail调控CDH1表达外，还正调控Snail表达。研究显示，Snail既可调控miRNA-34表达，也受miRNA-34调控。而且我们的前期研究显示CUL4B具有调控miRNA转录作用。那么，CUL4B调控Snail表达是不是通过miRNA-34介导的呢？为此，我们分析了干扰CUL4B对miRNA-34表达水平的影响。结果表明干扰CUL4B表达导致MDA-MB-231中miRNA-34a/b/c表达水平显著升高。我们进一步用ChIP实验检测CUL4B、DDB1和Snail在miRNA-34b/c启动子上的结合位点，表明CUL4B与DDB1和Snail结合在miRNA-34b/c启动子区域。为明确CUL4B调控的miRNA-34的功能效应，我们用miRNA34抑制剂进行了拯救实验，发现抑制miRNA-34能明显恢复由于干扰CUL4B所引起的Snail的表达下调。Transwell实验进一步证实了miRNA-34抑制剂能有效拯救干扰CUL4B引起的迁移能力降低。这些结果表明，CUL4B除了可以与Snail协同作用促进EMT进程以外，也可以通过抑制miRNA-34正向促进Snail表达。　　6.CUL4B协同Snail抑制CDH1表达，促进肿瘤细胞迁移:以上结果显示，CUL4B复合物可以通过直接调控CDH1和间接调控Snail进而调控CDH1而促进乳腺癌细胞EMT进程。为进一步证实其功能效应，我们在干扰MDA-MB-231 CUL4B表达的基础上，分析了过表达Snail和干扰CDH1的拯救效应。发现过表达Snail和干扰CDH1都能有效拯救由于干扰CUL4B引起的MDA-MB-231细胞迁移能力的降低。　　综上所述，本研究利用乳腺癌细胞模型研究了CUL4B在乳腺癌细胞EMT进程中的作用及其机制，发现CUL4B能有效促进乳腺癌细胞EMT进程;机制研究发现，CUL4B复合物一方面通过协同Snail/HDAC，促进了CDH1基因启动子区域H2AK119单泛素化和组蛋白去乙酰化，进而抑制CDH1转录;另一方面，CUL4B复合物还可以通过抑制miRNA-34表达进而正向调控Snail表达，促进EMT进程。