模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)具有个体小、遗传背景简单、生育周期短、种子数量多、基因组小且易于转化等优点,适宜进行遗传学分析。由于拟南芥基因组测序工作的完成以及饱和T-DNA插入的突变体库,为功能基因组学的研究提供了大量和环境胁迫有关的突变体,揭示了许多和环境胁迫调控的遗传学位点。但是如果详细揭示这些基因的功能及其在环境胁迫信号转导中的作用,需要综合运用多学科的技术,分析其在细胞信号转导途径中的位置和可能调控关系。本研究试图建立起来拟南芥根细胞的电生理学测定K+通道活性技术,同时将分子遗传学和细胞学技术结合起来建立起活体Ca2+浓度的监控技术,为逆境条件下的功能基因组学研究奠定技术基础。 利用膜片钳(patch clamp)技术研究根细胞质膜上通道特性的变化可以得到有关盐胁迫机制的许多有价值信息。但在膜片钳记录中,特别是进行药理学分析加入试剂处理时,存在封接成功率低、记录时间短、封接不稳等不足。为了获得高质量、适于膜片钳记录的拟南芥根细胞原生质体,我们从培养方法、酶解条件等方面进行了探索。分别以沙培养法、蛭石培养法、土培养法、水培养法、1/2 MS 培养基和 MS 培养基等不同的方法培养拟南芥,分析了不同培养方法对根生长发育的影响。从酶解方式、酶解温度、酶解时间等方面对酶解条件进行了探索。在膜片钳记录中对不同来源的根原生质体状态进行了比较,结果表明,不同培养条件对拟南芥根的生长影响很大,其中 MS 培养基和营养土培养的拟南芥根生长的粗大健壮,MS 培养基培养法分离的原生质体适于膜片钳记录,土培养法分离的原生质体更适于膜片钳记录。从而为盐胁迫机制的电生理学研究提供技术上的支持。 植物受到冷胁迫时,细胞质 Ca2+浓度迅速升高,Ca2+可以诱导一系列冷调节基因表达。但是,至今仍不知道植物细胞识别特异 Ca2+signature 的分子基础,有关 Ca2+信号转导到细胞核的许多中间成分和他们在冷胁迫信号途径中的时空位置在遗传学上尚未确定。由于 Ca2+信号的普遍性,研究 Ca2+信号的特异性也显得特别重要。CBF 转录因子是冷驯化信号途径的关键因子。我们通过杂交方法在 CBF 超表达突变体中表达水母发光蛋白基因。同时将含有水母发光蛋白基因的质粒转入农杆菌 GV3101 菌株中后,通过 PCR 筛选出了转化菌株。Floral dip 法