塞尼卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)Senecavirus病毒属的唯一代表。自2007年在加拿大被首次报道以来,在世界范围内相继出现。2015年在我国广东省首次发现SVA感染病例,其临床症状与口蹄疫极为相似,以发热、跛行、蹄冠及鼻镜出现水疱等为主要特征。目前市场上还没出现商品化的疫苗及诊断试剂盒,故建立一种快速准确的鉴别诊断方法对该病的防控至关重要。本试验建立了一种鉴别塞尼卡病毒A与口蹄疫病毒的双重RT-PCR方法和SVA间接ELISA方法。本试验根据SVA与FMDV保守序列设计了两对特异性引物,建立了一种检测SVA与FMDV的双重RT-PCR方法。通过对反应条件和反应体系的优化,确定了最佳退火温度为56.1°C,最佳引物浓度均为0.2μM,最佳10×PCR缓冲液使用浓度为1 mM,最佳Taq DNA聚合酶使用终浓度为2.5 U。进一步对该检测体系的特异性和敏感性进行分析,结果显示该方法对PEDV、SVDV、VSV、PRRSV、PCV、CSFV均无阳性扩增,对SVA和FMDV最低检测量分别为1.40×10~2拷贝/μL、1.10×10~2拷贝/μL,表明该方法具有良好的特异性和敏感性。利用本试验建立的检测方法对110份临床样品进行检测,结果表明SVA的阳性检出率为16.3%,FMDV的阳性检出率为1.8%,混合感染率为1.8%。同时将上述110份临床样品进行常规单重RT-PCR检测,其结果与双重RT-PCR检测结果一致。本试验成功的建立了一种检测SVA与FMDV的双重RT-PCR方法,为水疱性病原的临床诊断提供了一个很好的方法,同时为诊断试剂盒的研发打下基础。根据本实验室分离鉴定的SVA HN16株(GenBank登录号:MF893200)VP1基因序列设计一对特异性引物,同时在上游引物加入BamH I酶切位点,下游引物加入Xho I酶切位点。从阳性病料中扩增出VP1基因,测序成功后将正确的目的基因连接到pET-32a表达载体上,成功构建重组表达载体pET-32a-VP1并进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳初步鉴定重组融合蛋白大小为52 kD,主要以包涵体的形式存在。进一步对IPTG浓度和诱导时间进行筛选,确定最佳IPTG浓度为1 mM,最佳诱导时间为6 h。用上述确定的最佳诱导条件对重组蛋白进行大量制备,对纯化复性后的重组蛋白进行Western blot实验。结果表明,表达的目的蛋白能够与SVA阳性血清发生特异性反应,可用于间接ELISA方法的建立。将上述纯化复性后的重组蛋白作为间接ELISA的包被抗原,并对其条件进行优化,确立了最佳抗原包被浓度为5.5μg/mL,最佳封闭液为3%BSA,最佳封闭时间为37°C 2 h,最佳血清稀释比为1:100,最佳酶标二抗稀释比为1:5000,最佳底物显色作用时间为37°C 15 min。用统计学的方法确定阴阳性血清临界值为0.206,并进行特异性与重复性试验,结果表明该方法特异性、批内批间重复性均良好。本实验初步建立的SVA VP1蛋白间接ELISA方法具有可行性,为以后SVA间接ELISA诊断试剂盒的研发奠定了基础。