电化学DNA生物传感器具有灵敏度高、特异性好、携带方便、耗能少等优点,与各种信号放大策略和可再生策略相结合,可以实现对检测目标的痕量分析,受到了研究者们的广泛关注,目前已成为当今生物学、医学领域的前沿性课题。然而,开发高灵敏度的电化学DNA生物传感器仍然面临很多挑战。在电极与溶液的界面上,传质速率的减小和拥挤效应的增加,使得DNA的识别与杂交受到很大影响。DNA纳米技术的出现,为电化学DNA生物传感领域中出现的难题带来了新的解决方案。我们设计不同的二维DNA纳米探针结构,来提高纳米传感界面上的化学稳定性和生物相容性。本论文利用二维DNA纳米结构构建多元、协同的纳米传感界面,并通过调控纳米界面来实现目标DNA分子的高特异性捕获与识别,本文构建了三种电化学DNA生物传感器,具体研究内容如下:1.传统的微生物学分析在许多紧急情况下,由于耗时长、不便于携带等原因使其发展受到了阻碍。本实验开发了一种新型的电化学DNA生物传感器,使用多腺嘌呤(polyA)探针对五种细菌的16S rRNA基因进行检测分析。polyA捕获探针由polyA尾和识别探针两部分组成,其中polyA尾巴可以结合到金电极表面上,并且通过改变polyA的长度,可以控制电极表面组装密度,提高捕获探针的识别效率;polyA捕获探针的识别部分与两个生物素标记的信号探针一起与目标DNA杂交,形成稳定的DNA四聚体夹心结构,然后与链霉亲和素修饰的辣根过氧化酶(avidin-HRP)反应,在3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)中可以产生氧化还原电流信号,实现电化学检测。该方法对人工合成的目标检测限(LOD)可达10 fM,并具有良好的选择性和重复性。重要的是,由于多信号探针体系的碱基堆积力作用,使得我们设计的实验方案有助于破坏二级结构,稳定探针目标的结合。我们构建的电化学DNA生物传感器在检测细菌基因组DNA时,同样具有良好的检测能力。最后,我们的生物传感器是在16通道电极芯片上构建的,不需要进行任何聚合酶链反应(PCR),实现了五种细菌的单细菌的水平检测,这对开展便携式细菌生物传感检测具有非常重要的意义。2.多嵌段DNA探针由于开发了多靶点生物传感器和提高了其与目标杂交的特异性/灵敏性而引起了广泛的科学关注。但是多嵌段DNA探针的开发,高度依赖有机连接基团或纳米材料的有机化学合成,因此,限制了它们与目标结合的生物相容性和实用性。在这项工作中,我们开发了基于三嵌段DNA捕获探针的无标记组装策略,该探针是由两个DNA探针与其固有的多腺嘌呤连接起来构成(探针-PolyA-探针,PAP)。中间的polyA片段与金电极表面有很好的结合作用,这使得我们的生物传感器具有极好的重现性、稳定性和再生性。将两个侧翼捕获探针串联在电极表面,使得捕获探针在空间上构成关系一致,数量完全相同的组装体系。当与靶DNA结合时,由于我们体系的碱基堆积力作用,有助于破坏目标二级结构和稳定探针目标的结合,提高了杂交稳定性。我们的生物传感器的灵敏度为10 fM,分析范围在10 fM至1 nM之间。当面对错配的DNA序列时,我们基于三嵌段DNA捕获探针的生物传感器显示出极好的特异性,并且捕获探针可以实现单碱基错配的能力。我们的生物传感器具有很好的实用性,在没有使用到PCR扩增技术的条件下也可以进行分析基因组DNA。3.初步探究了基于金电极表面构建“三角形”polyA-DNA在空间的电荷传递情况,初步发现没有目标存在时,没有电流信号值,当目标存在时二茂铁修饰的捕获探针的茎环被打开,使得二茂铁更加接近电极表面,可以检测到电流信号,这对研究界面组装的构型开拓了一些新的思路。