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目的:利用CRISPR-Cas9系统从基因组水平上分别敲除编码基因MKL1和长链非编码RNA HOTAIR。为研究在宫颈癌中MKL1与HOTAIR的作用,构建二者缺失型HeLa细胞株,扩大该系统的应用范围。同时,利用这两种细胞体系验证MKL1和HOTAIR的细胞功能;建立二者与肿瘤抑制因子间的联系,为两者功能机制的研究提新出方向。方法:首先构建出稳定表达Cas9核酸酶的HeLa细胞株。其次,分别设计特异性靶向MKL1和HOTAIR基因的pgRNA引物,克隆其表达质粒,导入上述细胞株,构建相应的CRISPR-Cas9系统。细胞经药物筛选后,利用Western Blot蛋白分析和qRT-PCR定量分析分别确定MKL1和HOTAIR的敲除效率。通过MTT实验与细胞划痕实验检测目的基因缺失型HeLa细胞株增殖与迁移的变化。同时,提取这两类细胞株的RNA,qRT-PCR测定肿瘤抑制因子p21,p53,pRB以及DLC1转录水平的变化。其中针对MKL1对DLC1的调控进一步探究,利用生物信息学分析DLC1启动子序列,检测在HeLa细胞中过表达MKL1对DLC1表达水平的影响,同时构建启动子突变型荧光素酶报告基因质粒,配合ChIP实验验证MKL1对DLC1的调控作用。结果:利用稳定表达Cas9核酸酶的HeLa细胞株分别构建了靶定MKL1和HOTAIR基因的CRISPR-Cas9系统。Western Blot蛋白分析与qRT-PCR定量分析分别显示MKL1基本被敲除,而lncRNA HOTAIR表达只下调60%,未完全敲除。随后MTT实验表明MKL1缺失以及HOTAIR下调的HeLa细胞一周内增殖数量少于对照组;细胞划痕实验也显示这两类细胞的划痕愈合速度低于对照组。对于相关肿瘤抑制因子的影响,qRT-PCR检测显示MKL1缺失时,p53转录水平无明显变化,DLC1的下调80%,而p21与pRB上升1.5倍左右;HOTAIR下调时,DLC1和p53转录水平下调,而p21和pRB的转录水平明显上调。生物信息学分析得知DLC1上游1000bp启动子内含有两个CArG box序列;MKL1的过表达会上调DLC1的转录表达,同时ChIP实验和荧光素酶报告基因实验表明MKL1在DLC1启动子上有结合,且两个CArG box分别突变都会抑制DLC1的转录。结论:该实验在CRISPR-Cas9系统中应用pgRNA可显著敲除MKL1,而对lncRNA HOTAIR的敲除并不彻底,令其下调60%,具体原因还有待实验探究。此外,MKL1缺失及HOTAIR下调皆可抑制HeLa细胞的增殖和迁移,并对不同肿瘤抑制因子的转录水平有不同的影响,暗示MKL1和HOTAIR可通过调控肿瘤抑制抑制参与细胞周期的调控,同时也为MKL1和HOTAIR新的作用机制研究提供了方向。如该实验研究发现MKL1可通过与DLC1启动子上的CArG box结合从而促进后者的转录表达。该实验结果表明了应用的pgRNA-Cas9系统敲除目的基因的应用价值与其局限性,而对于MKL1和HOTAIR对其他肿瘤抑制因子调控的具体机制,则有待在后续实验中进一步探究。