研究背景弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是WHO分类中最常见的一种非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma, NHL),属于成熟B细胞淋巴瘤,在临床表现、组织形态、免疫表型和预后等多方面存明显异质性。我们国家,在最常见的肿瘤类型中排第8位,2009年DLBCL的发病率约为6.68/10万,近年来其发病率呈逐年上升的趋势[1,2]。每年发病率约占淋巴瘤的35.8%。DLBCL常见于老年患者,中位发病年龄60岁[3,4]。根据细胞起源(cell of origin, COO)分型,DLBCL可分为生发中心B细胞型(germinal centre B cell like,GCB)和非生发中心B细胞型non-germinal centre B cell like, non-GCB)。2000, Alizadeh等通过基因表达谱(gene expression profiling, GEP)分析B细胞基因表达情况,根据细胞生发中心来源或活化中心来源,首次提出将DLBCL分为生发中心型和活化中心型(activated B cell like, ABC)两种临床亚型,并认为GCB型预后显著优于ABC亚型[5]。GCB型、ABC亚型被用于临床,指导临床分型及治疗,GEP是判断DLBCL细胞亚型的金标准,但由于GEP技术过程复杂、费用昂贵,在临床推广应用难度大,因此不少研究者致力于寻找简单可行的病理学标记来对DLBCL进行临床分型参考及指导预后。2004年,Hans等应用免疫组化检测Bcl-6、CD10、MUM1、cyclin D1、FOXP1等在DLBCL中的表达情况,提出CD10、bcl-6为生发中心期B细胞标记、MUM1为活化中心期B细胞标记。通过检测Bcl-6、CD10、MUM1三个免疫标记将DLBCL分为GCB型、non-GCB型,non-GCB亚型可作为提示预后差的独立因素[6]。但是这种划分方法与DLBCL的基因表达并非完全吻合,其他的标记如Bcl-2和cyclin D2可能有助于更完善的DLBCL免疫分型。随后,不少研究者提出,应用GCET1、CD10、 BCL6、MUM1、FOXP1五个标记进行细胞来源分型与GFP检测基因表达分型吻合度更高[7-9]。在我国,目前仍多应用Hans提出Bcl-6、CD10、MUM1三步分型法对DLBCL患者进行临床分型。DLBCL是一组异质性很强的疾病,不同患者预后不同,影响预后的临床因素有年龄、是否出现全身症状、血清乳酸脱氢酶水平、血清β2-微球蛋白、Ann Arbor分期、肿瘤大小、淋巴结的数目及结外受累数目、骨髓是否侵犯。自1993年国际非霍奇金淋巴瘤预后研究组制定淋巴瘤国际预后指数(International prognostic index, IPI)及年龄调整预后指数(age-adjusted international prognostic index, aa-IPI)应用于非霍奇金淋巴瘤的预后评估,这一指标一直在临床广泛应用至今。IPI评分是目前最公认的判断淋巴瘤预后的临床指标。预后不良因素包括：年龄>60岁、病变为Ⅲ/Ⅳ期、LDH>正常值上限、ECOG体能状态评分≥2分及结外侵犯部位≥2处[3]。低危组(0-1分)、低中危组(2分)、高中危组(3分)、高危组(4-5分),患者5年总体生存率分别为70%-80%、50%-60%、40%-50%和20%～30%[10]。年龄调整的IPI以病变为Ⅲ/Ⅳ期、LDH>正常值上限、体能状态ECOG (Eastern Cooperatie Ontology Group)评分>2作为评分标准,适用于年龄<60岁的患者[3]。IPI评分是预后差的独立预后相关因素,IPI3-5分预后差、死亡率高[6,11,12]。上个世纪70年代起,DLBCL的标准治疗为CHOP(环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+泼尼松)方案法化疗,完全缓解(complete responses, CR)率40%-50%,3年无进展生存(progression-free survival, PFS)、总生存(overall survival,0S)分别为30%-44%、35%-52%[13,14]。自抗CD20单克隆抗体问世,近10几年来抗CD20单抗联合CHOP的RCHOP方案已逐渐取代CHOP成为弥漫大B细胞淋巴瘤的标准治疗。RCHOP方案化疗患者CR率75%左右,5年PFS.OS为60%、62%-68%,患者近期效果及远期生存率均显著提高[9,15,16]。CHOP、RCHOP化疗在老年或年轻DLBCL患者中疗效均有显著差异。如上所述,CD20单抗的出现、免疫化疗应用临床后,患者完全缓解率提高了30%,但仍有部分患者表现为原发耐药或缓解后复发。对于临床新诊断的患者,若能通过有效的预后指标判断化疗效果,鉴别出是否易原发耐药或难治复发,制定个体化治疗方案,可提高DLBCL患者整体生存率的关键。例如,对指示预后较较差的这部分DLBCL患者,早期给予更强的治疗方案(如强烈化疗、生物学治疗、自体干细胞移植等),可能会使这部分的患者获益,从而改善预后。GCB型和non-GCB型患者对化疗的反应不尽相同,两种临床亚型在基因表达上具有明显差异,除IPI评分3-5分外,non-GCB型也认为是预后差的独立因素[5,6,9,17]。同时,也有学者认这两种临床亚型无显著差别。指导预后最常用的是IPI评分,IPI评分对预后的指导有一定的局限性,临床上不同患者相同的IPI评分、分子生物学标志不同可能结局不同。因此,寻找除IPI评分之外能评估该病与预后相关分子生物学指标对指导个体化治疗就显得尤为重要,也是目前弥漫大B细胞淋巴瘤研究的重要内容之一。目前,越来越多的研究者在不断探索能有效指导预后的分子生物学指标。国内外文献已分别报导了Bcl2、MUM-1、FOXP1、CD5、CD30、CD44、CD43、Bcl-2、Bcl-6、CD138等分子免疫学标记对预后的影响,并提出不同的临床亚型分型标准[6,9,20,21]。目前,对于肿瘤发病及进展的研究不仅集中在肿瘤细胞本身的病理变化,自1979年Lord提出肿瘤微环境的概念以来,肿瘤微环境已成为近年来在癌症研究中进展最快的领域之一。肿瘤发展过程不仅与肿瘤细胞自身的生长增殖有关,还与基质、新生血管及大量浸润炎症细胞有关,也就是肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)。TEM主要包括肿瘤细胞、活化的成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞、血管、细胞外基质、多种细胞因子、炎症因子以及特殊的理化环境(如低氧、低PH)[22-24]。它们参与肿瘤的侵润、进展和转移并影响肿瘤细胞的生物学特性,且随着肿瘤的发展而不断进化。关于肿瘤微环境与肿瘤间的研究主要包括：肿瘤细胞与微环境中各型相关细胞共同作用促进肿瘤侵袭和转移,肿瘤细胞与其组织微环境间动态的关系,在肿瘤的发生和发展过程中肿瘤细胞与细胞外基质之间的相互作用。本课题组主要研究CD44在细胞迁移、扩增及存活方面的作用,CD44胞内区在non-GCB亚型DLBCL中潜在作用及CD44表达的预后意义。我们前期研究发现CD44H高表达与骨髓侵犯密切相关,CD44H和CD44v6表达是DLBCL预后不良的因素。CD44在non-GCB亚型DLBCL细胞株中高表达;CD44表达抑制后,non-GCB亚型DLBCL细胞株增殖及细胞的增殖、迁移及存活均降低。另外,分析168例DLBCL患者,发现外周血中淋巴/单核细胞比例降低(≤2.6),是RCHOP化疗的non-GCB型DLBCL患者预后不良的因素；淋巴/单核细胞比例降低对GCB亚型患者生存无显著影响[25]。外周血单核细胞相对增多与淋巴瘤B细胞通过募集单核细胞促进瘤细胞本身的存活与增殖而抑制正常的T细胞的作用相关[26]。CD44作为淋巴细胞“归巢受体”,介导淋巴细胞与毛细血管后小静脉中的高柱状内皮细胞结合,促使淋巴细胞穿过血管壁从外周回到淋巴组织。外周血淋巴细胞相对降低增高影响non-GCB型而不是GCB型DLBCL患者预后,结合我们之前实验证实CD44v6在ABC细胞株中高表达,对于这一临床现象,我们认为外周血淋巴细胞相对减少跟CD44对其的黏附作用使淋巴细胞进入外周血减少。CD44v6除了影响瘤细胞本身转移外,是否与肿瘤细胞周围细胞的迁移、运动相关,因此我们实验对DLBCL中CD44v6表达情况与肿瘤微环境之间的关系进行初步探索。xCT：胱氨酸/谷氨酸转运体,主要作用是转运1分子胱氨酸进入细胞内的同时释放1分子谷氨酸到细胞外,进入胞内的胱氨酸在细胞内迅速还原成半胱氨酸。一部分半胱氨酸参与谷胱甘肽(glutathione, GSH)的合成,用于清除氧自由基；另一部分则出胞氧化成胱氨酸。GSH,是体内清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要成分之一,两者一起被视为细胞抗氧化能力重要的指标。已知在几种实体瘤中,CD44的剪接异构体CD44v8-10,能够增强xCT的蛋白稳定性,促进胞内GSH的合成,拮抗化疗引起的ROS,从而诱导多药耐药。文献报道抑制CD44的水平可以降低xCT的表达和抑制其功能,增加细胞内ROS水平。自然杀伤细胞(natural killer cells, NK)细胞：具有在体外溶解多种肿瘤细胞、清除移植瘤以及参与自发免疫监视作用。NK细胞的功能特点是在体外既不需要预先致敏,也不受基因型的限制,并且不需要其他抗体参与就能迅速的杀伤靶细胞。与T淋巴细胞、B淋巴细胞不同,NK细胞不进行胚系内编码抗原受体的基因重排,NK细胞不受MHC限制。NK细胞具有多种表型,并与其具有的多种免疫功调节功能有关,部分功能与其抗肿瘤特性密切相关。CD57可用来作为鉴别NK细胞的表面标记。巨噬细胞：巨噬细胞由起源于骨髓的单核细胞经过血液循环后募集在不同组织中而分化形成。在不同的反应环境中不同的刺激物作用下巨噬细胞发生不同方向的活化,肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macroohages, TAMs)主要分为两类：经典活化的巨噬细胞(Classically activated macrophage caMphi, Ml)和替代性活化的巨噬细胞(Alternatively activated macrophage aaMphi, M2)。CD68可作为鉴定M1巨噬细胞特异性表面标记,CD163可作为鉴定M2型巨噬细胞特异性表面标记。缺氧是实体瘤的特征之一,是肿瘤微环境的代表性特征,肿瘤细胞能更好的逃避和适应缺氧环境,缺氧细胞更易耐放化疗。高浓度的活性氧环境下能够增加肿瘤细胞对化疗的敏感性,及诱导细胞凋亡。而巨噬细胞、NK细胞作为微环境中的免疫细胞易在实体瘤内缺氧坏死区域聚集。目的本研究以南方医院确诊、接受RCHOP方案及RCHOP样方案化疗4个疗程以上的弥漫大B细胞淋巴瘤患者为研究对象。对其石蜡包埋病理组织切片进行相关免疫组化检测(CD44v6、xCT、CD57、CD68、CD163、CD10、Bcl-6、Mum-1),并对患者临床资料进行统计分析,观察所有抗原表达与临床参数。本实验主要检测CD44v6、xCT蛋白、NK细胞、巨噬细胞在DLBCL的表达情况及对临床疗效、预后的影响、探索它们之间的关系。分析表达CD44v6、xCT和肿瘤微环境中NK细胞、巨噬细胞高浸润的患者临床特点。材料和方法收集南方医科大学医学南方医院2004年6月～2012年10月诊断且住院接受RCHOP4疗程以上正规化疗,临床资料、随访较全的弥漫大B淋巴瘤的病例77例。所有病例均经我院病理科病理形态学和免疫组织化学确诊,且经两名以上病理专家重新复阅病理切片。记录患者的临床特征包括性别,年龄,Ann Arbor分期,体能状态评分(Eastern Cooperatie Ontology Group, ECOG),发热、消瘦、盗汗等全身症状,血清LDH水平,结外侵犯数目,IPI评分,巨大肿块,是否有骨髓侵犯等指标,以及初始治疗4疗程后疗效、治疗有效维持时间、疾病进展或复发的时间和部位,以及长期随访资料等。收集病理科2004年6月～2012年10月间在我院诊断患者病理标本,切片后进行免疫组化染色。高倍显微镜下观察CD44v6、CD10、CD57、xCT、Mum1、 Bcl-6、CD68、CD163抗原表达情况并进行细胞计数分析。结果1.免疫组化结果：结合病例资料,所有患者,CD20均为阳性,且均进行CD10、Bcl6、MUM1染色。参照上述阳性标准评估77例DLBCL患者病理组织中及瘤细胞周围细胞染色结果,77例患者,CD44v6、xCT, CD57、CD68、CD163阳性患者分别为51例(66.2%)、25例(32.5%)、37例(48.0%)、67例(87.0%)、61例(79.2%),其中CD68强阳性10例、CD163强阳性14例。CD57阳性细胞数为1-82个／高倍镜,平均为12.3个／高倍视野。2.病历资料：77例弥漫大B细胞淋巴瘤患者,其中男性51例,占患者总人数的66.2%,女性26例,占33.8%；发病年龄低于60岁62例,大于60岁16例；患者病理切片部分进行CD3, CD45R0, Bcl2, Ki67, CD21, CD10, Bcl6, Muml免疫组化染色。我们进行CD10, Bc16, Mum1免疫组化染色后,结合临床资料根据Hans分型法将患者分为GCB型,non-GCB型。其中GCB组患者共25例,占患者总人数的32.5%,non-GCB组患者共52例,占患者总人数的67.5%。3.疗效评估：77例DLBCL患者,完全缓解CR66.2%(51/77),部分缓解PR14.3%(11/77), SD+PD19.5%(15/77). CR/CRu+PR认为化疗有效,SD+PD认为化疗无效,总体有效率77.7%。化疗无效的患者随后改用RCHOPE、REPO、RGDP、RDICE、 REPOCH等二线化疗方案化疗或进行自体移植。4.生存情况：截至随访日期,一共25例患者复发,总体复发率为32.5%,16例患者死亡,死亡率为20.7%。5.统计分析：采用Spearman相关分析对CD44v6、xCT表达水平和NK细胞、M1、M2型巨噬细胞肿瘤周围浸润情况与临床指标(性别,年龄,C00分型,AnnArbor分期,ECOG评分,发热、消瘦、盗汗等B症状,血清LDH水平,结外侵犯数目,IPI评分,巨大肿块,是否有骨髓侵犯)的相关性进行统计分析。结果显示,xCT阳性患者LDH增高,NK细胞阳性患者IPI评分危险度分层更高,M1型巨噬细胞高浸润患者临床Ann Arbor分期较晚、体能状态差并易出现结外累及。应用二元Binary logistic回归分析将各抗原的表达水平和临床指标对疗效的影响进行单因素分析,Ann Arbor分期、IPI评分与疗效负相关(B值分别为-1.612、-1295),性别、年龄、C00亚型、ECOG评分、B症状、LDH水平、结外累及数目、巨大包块、骨髓侵犯、CD44v6、xCT表达、CD68阳性巨噬细胞、CD163阳性巨噬细胞、NK细胞对疗效无显著影响。多因素分析结果显示,仅IPI评分是影响临床疗效的相关因素,(P=0.034)。Kaplan-Meier生存分析,结果显示RCHOP化疗的DLBCL患者平均EFS时间为58.7±4.7月,OS时间83±4.5月；3年EFS率和OS率分别为58.6%和79.2%。同时,根据C00亚型分组分析DLBCL患者生存情况,GCB亚型、non-GCB亚型两组患者EFS时间分别为76.0±6月、49.0±6月,3年EFS率分别为81.8%、46.5%,GCB组患者EFS更好(P=0.005)；GCB亚型、non-GCB患者0S时间分别为82.7±4.4月高于non-GCB亚型的77.0±6月,两组3年0S分别为90.3%的70.6%,GCB组0S优于non-GCB组,但差异无统计学意义(P=0.057)。Cox回归模型分析临床参数包括：性别,年龄,Ann Arbor分期,ECOG评分,B症状,血清LDH水平,结外侵犯数目,IPI评分,巨大肿块,骨髓侵犯对预后的影响。结果显示ECOG评分、B症状、血清LDH水平、IPl分期对患者EFS有显著影响,P值均<0.05,有统计学意义；B症状对患者0S有显著影响(P=0.027)。而性别,年龄,Ann Arbor分期,结外侵犯数目,巨大肿块,骨髓侵犯对生存无显著影响。分析淋巴瘤组织中CD44v6、xCT蛋白的表达强度和组织中巨噬细胞、NK细胞浸润情况对OS, EFS的影响。结果提示xCT抗原、M1型巨噬细胞高度浸润影响患者EFS; CD44v6、M2型巨噬细胞浸润与患者OS相关。对影响EFS的C00分型、ECOG、全身症状、血清LDH水平、IPI分期、xCT、M1型巨噬细胞进行多因素分析,结果显示IPI分期、C00分型、M1型巨噬细胞、xCT是影响EFS的相关因素。对影响总生存的全身症状、CD44v6、M2型巨噬细胞等因素进行多因素分析,结果提示CD44v6和M2型巨噬细胞浸润是影响患者0S的相关因素。CD44v6、xCT表达水平、肿瘤周围M1、M2型巨噬细胞和NK细胞浸润之间的相关性分析：肿瘤微环境中巨噬细胞M1型与M2型浸润显著相关,其他两两间并无显著相关性。结论1.CD44v6阳性患者预后差,主要影响OS,临床表现无特异性。2.xCT是DLBCL患者EFS差的不良因素,阳性表达时伴有LDH增高。3.NK细胞浸润患者IPI评分危险度更高。4.M1型巨噬细胞高浸润时改善预后,M2型巨噬细胞浸润预后差。5. non-GCB型DLBCL患者预后差。6.CD44v6、xCT、肿瘤相关巨噬细胞细胞浸润的DLBCL患者临床表现无特异性。