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神经退行性疾病是一类进行性发展的神经系统功能障碍疾病,其主要的特征为特异性神经元结构或功能的逐渐丧失,且病理变化不可逆。主要包括帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD)、不同类型脊髓小脑共济失调(Spinocerehenar ataxia,SCA)、遗传性痉挛性截瘫(Hereditary spastic paraplegia,HSP)等。对于此类疾病的治疗仍局限在对症处理,尚无有效治疗方法及药物可阻止病情发展。该类疾病影响世界数百万人,给患者和医护人员带来巨大痛苦及压力,给整个社会造成非常大的经济负担。我们在山东省内收集到两个神经退行性疾病家系,分别为脊髓小脑性共济失调(SCA)和遗传性痉挛性截瘫(HSP),分离出SCA致病基因SMEK1及HSP致病基因KIF1A,针对两个致病基因,我们进行了其功能及致病机制的研究探讨。(1)SMEK1 K572T错义突变导致SCA发生的相关机制研究本课题组通过连锁分析及全外显子组测序技术,筛选出SCA新型致病基因SMEK1。该家系患者SMEK1基因第1715位腺嘌呤突变为胞嘧啶(c.1715A>C),从而导致SMEK1蛋白第572位赖氨酸被苏氨酸替代(p.K572T),这种错义突变导致SCA发病。多项研究表明,SMEK1(Suppressor of MEK1)基因在早期神经发育过程中发挥了重要作用,主要负责调控神经干细胞的增殖与分化。为了研究SWEK1 K572T错义突变是否影响了早期神经发育过程,我们构建了Smek1K572T基因敲入小鼠模型,并获得了三种基因型胎鼠神经干细胞。对获得的神经干细胞进行体外培养时,我们发现纯合子(Smek1mut/mut)及杂合子(Smek1wt/mut)神经干细胞具有更强的干性及增殖能力。随后的体外神经分化实验结果显示,Smek1 K572T错义突变阻碍了神经元的分化,促进了神经胶质细胞的分化。据文献报道,Notch信号通路在哺乳动物发育中参与神经发生过程,其对神经干细胞的干性维持、分化以及命运决定也发挥着重要作用。因此我们利用三种基因型神经干细胞以及SMEK1野生/突变高表达细胞系检测了 Notch信号通路关键分子的表达,蛋白检测结果显示Smek1K572T错义突变后,神经干细胞内NICD的表达量上调,调控神经分化的HES1以及HES5表达明显升高。以上结果说明,Smek1K572T错义突变异常激活了 Notch信号通路,增强了神经干细胞干性及增殖能力,阻碍了神经元细胞的分化,影响了早期神经发育过程。此外,我们发现Smek1 K572T错义突变导致SMEK1蛋白发生了累积,从而导致内质网功能紊乱,引起内质网应激,激活未折叠蛋白反应(UPR)中的PERK通路,PERK通路中关键分子的mRNA水平及蛋白水平都发生明显上调。而SMEK1WT及SMEK1Mut过表达后,PERK通路发生负反馈调节。据文献报道,内质网与线粒体之间通过一个特殊结构域形成紧密物理连接,该结构域为线粒体-内质网偶联结构域(MAM),其为两细胞器进行交互作用的功能平台。当内质网形态发生变化时,会增加内质网与线粒体之间关联程度,进而改变线粒体形态学。因此,我们进一步研究了Smek1K572T错义突变是否影响了线粒体的结构与功能。MEF细胞透射电镜结果显示,Smek1mut/mut MEF细胞内粒体出现明显肿胀、膜内基质变淡以及嵴消失,部分严重者基质溶解,空泡变。MEF细胞线粒体活染显示,Smek1mut/mutMEF细胞内粒体分裂融合异常,同时观察到调控线粒体分裂融合的相关蛋白表达出现异常。综上,我们确定了 SMEK1K572T错义突变异常激活了 Notch信号通路,阻碍了早期神经发生过程。并且观察到SMEK1 K572T错义突变使得蛋白发生异常累积,激活了未折叠蛋白反应中的PERK通路,同时使得线粒体结构与功能发生异常,从而导致SCA的发生。以上结果为进一步探讨SMEK1功能以及SMEK1 K572T错义突变导致SCA发生致病机制的研究提供了思路。(2)HSP KIF1AT258M患者hiPSCs建立及hiPSCs神经诱导分化条件探索。大部分神经系统遗传性疾病都具有显著的遗传及临床异质性,同一基因的不同突变模式所引起病理表征差异较大。因此无论是体外细胞模型以及动物模型,都无法特异性的研究致病基因功能及其致病机制,而疾病特异性的人多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)具有患者全套的遗传物质,利用其研究疾病发生过程中分子水平及细胞水平的变化更具有说明性。本课题针对收集到的一常染色体显性遗传性痉挛性截瘫家系,前期已通过全外显子组测序技术,分离鉴定出致病基因KIF1A,该基因第773位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶(c.773C>T),形成错义突变(p.T258M)从而导致HSP发生。在伦理委员会批准及家系成员知情同意后,我们采取了该家系患者及正常人的外周血,分离出PBMC细胞,通过非病毒非整合方法诱导获得HSP疾病特异性hiPSCs。获得的hiPSCs具有较大核仁,较高核质比,并表达干性基因,传至第十代时,外源基因关闭,内源基因开启,并具有向三胚层分化的潜能,且并未发生染色体变异及支原体污染。对诱导而来的人多能干细胞完成鉴定后,我们对体外神经诱导方法进行了摸索,成功实现拟胚体形成,以及将hiPSCs成功诱导成神经干细胞,并对其完成了早期诱导分化和成熟神经诱导分化,诱导出神经元细胞和神经胶质细胞。综上所述,我们已经成功构建了 HSP KIF1AT258M患者来源的人诱导性多能干细胞,并成功对其进行了神经诱导及分化,为进一步研究KIF1A功能以及KIF1AT258M致病机制研究提供了细胞模型,同时该细胞模型可用于药物筛选和临床治疗研究。