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急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是一种肾功能在短期内急性减退的临床综合征,其发病迅猛,死亡率高。常见的诱因包括脓毒症、缺血再灌注损伤等,尚缺乏有效的药物治疗手段。研究表明,线粒体氧化应激损伤是多种AKI共同的关键病理机制之一。因此,抗氧化治疗成为重要的治疗手段。传统的抗氧化剂对AKI的临床疗效有限,这可能与其肾脏生物利用度低、线粒体富集不足有关。SS31作为一种阳离子线粒体靶向肽,具有较强的抗氧化活性,是治疗AKI的候选药物。但SS31具有血浆酶降解性高、代谢快以及组织靶向性差等缺点,影响其体内疗效。本研究针对两种类型的AKI（脓毒症诱导的AKI和缺血再灌注诱导的AKI）,制备了两种不同的SS31递送系统,在血液循环中保护SS31免于降解并靶向递送SS31到达AKI损伤区域,从而更好地发挥线粒体靶向抗氧化治疗作用。微血管内皮细胞氧化应激是脓毒症诱导AKI的重要损伤机制。在脓毒症AKI损伤的血管内皮细胞上,黏附因子CD44表达异常增加。透明质酸是CD44的特异性配体之一,也是一种生物相容性良好的天然阴离子多聚物。本研究以透明质酸钠（sodium hyaluronate,HA）为载体材料,以阳离子抗氧化肽SS31为药物,辅以天然阳离子载体壳聚糖（chitosan,CS）,通过静电相互作用制备了三元纳米复合物HA/CS/SS31。研究表明,粒径较小且分布均一的纳米制剂易于在肾脏聚集。本研究考察了不同CS投料量和分子量对HA/CS/SS31粒径的影响,结果表明CS投料量越少,HA/CS/SS31粒径越小、多分散系数（polydisperse index,PDI）越大,且20 k Da分子量的CS比2.5 k Da的CS更有利于形成粒径均一的纳米复合物。本研究最终选择20 k Da分子量的CS为载体,以0.33%的CS投料量,制备得到了粒径为53±0.17 nm、PDI为0.207±0.06、ζ-电位为–19.6±0.7 m V的HA/CS/SS31。HA/CS/SS31具有良好的SS31负载能力,载药量达到10.5±0.2%,包封率达到94.0±2.0%。采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）考察HA/CS/SS31在不同p H介质中的药物释放行为,结果表明HA/CS/SS31呈p H响应性药物释放特征,在p H 7.4的生理条件下孵育5min后,释放量约为6%;而在p H 4.5的酸性条件下,5 min内可释放70%以上的药物。采用透射电子显微镜和微粒粒度与表面电位测定仪考察HA/CS/SS31在不同p H介质中孵育5 min后的粒径形态变化,结果显示p H越低,HA/CS/SS31的粒径越大,形状越不规则,进一步证实了其p H响应性。溶血实验表明HA/CS/SS31符合溶血安全范围。以人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）为模型细胞,采用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激HUVECs构建脓毒症AKI细胞模型,考察了HA/CS/SS31的细胞毒性、摄取和药物释放行为。HA/CS/SS31表现出低细胞毒性。与正常细胞相比,CD44受体过表达的LPS刺激细胞具有更好的HA/CS/SS31摄取能力。随着孵育时间的延长,SS31逐渐从HA/CS/SS31中释放。释放的SS31靶向分布到线粒体,发挥抗氧化功能。以H2O2刺激HUVECs构建氧化应激细胞模型,考察了HA/CS/SS31的抗氧化应激和抗凋亡作用,结果表明,HA/CS/SS31与游离SS31、HA/SS31和HA/CS相比,可更有效地提高H2O2刺激细胞的存活率,降低细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,稳定线粒体膜电位,减少凋亡细胞的数目。以ICR小鼠为模型动物,通过肾内注射LPS构建脓毒症AKI动物模型。尾静脉注射HA/CS/SS31后,采用活体成像仪考察HA/CS/SS31的体内分布情况。结果表明,HA/CS/SS31可有效分布在AKI肾脏中,且其AKI肾脏靶向性与HA和损伤肾脏组织过表达的CD44受体之间特异性相互作用有关。以游离SS31、HA/SS31和HA/CS为对照,尾静脉给药后,考察HA/CS/SS31对脓毒症诱导AKI小鼠的治疗作用。结果表明,HA/CS/SS31治疗显著降低了AKI小鼠血肌酐和尿素氮水平,减少了肾小管坏死、细胞脱落和管型等组织损伤,缓解了线粒体内外膜破裂、嵴缺失和肿胀,降低了氧化应激因子丙二醛（malondialdehyde,MDA）、炎症因子白介素-6（interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的水平,减少了巨噬细胞浸润和肾脏组织的细胞凋亡。血药浓度-时间曲线表明HA/CS/SS31可有效延长SS31半衰期。HA/CS/SS31对SS31有效的保护和靶向递送是其良好AKI治疗效果的重要原因。肾缺血再灌注（ischemia reperfusion,IR）损伤是临床上导致AKI的最常见原因,肾小管上皮细胞线粒体氧化应激损伤是缺血再灌注诱导急性肾损伤（IR-AKI）关键的发病机制之一。因此,SS31也是IR-AKI潜在的治疗药物。药物先到达肾小管管腔,再从肾小管上皮细胞的顶端侧进入细胞是目前报道的肾小管上皮细胞靶向药物递送的主要路径。此过程需克服肾小球滤过等诸多生理屏障,对递送系统的尺寸大小具有一定要求,一般需要满足粒径小于5 nm,分子量小于70 k Da;另外,带正电的递送系统更容易被肾小球滤过到达肾小管。共轭物前药是一种新型药物递送系统,通常以具有良好生物相容性的高分子材料为载体,通过共价键将载体和药物连接,从而提高药物递送效率。通过合理的载体和连接键设计,合成低分子量共轭物前药,有望实现对SS31的保护、肾小管上皮细胞主动靶向递送和药物可控释放,最终实现SS31的IR-AKI高效治疗。研究表明,肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1,KIM-1）是在AKI损伤肾小管上皮细胞膜上表达异常增加的内吞受体,这为共轭物前药的主动靶向提供了可能。丝氨酸可与KIM-1构象匹配,参与KIM-1介导的内吞作用。基于此,本研究以分子量2.5 k Da的阳离子材料CS为基本骨架,通过酰胺反应合成L-丝氨酸修饰的壳聚糖（L-serine modified chitosan,Ser-CS）作为药物载体。以ICR小鼠为模型动物,采用双侧肾动脉夹闭法构建IR-AKI小鼠模型,考察Ser-CS在AKI肾脏中的分布,结果表明,与对照组CS、聚乙二醇修饰的壳聚糖（PEG-CS）和L-丝氨酸-聚乙二醇修饰的壳聚糖（Ser-PEG-CS）相比,Ser-CS具有最佳的AKI肾脏聚集和滞留能力,可快速有效地分布在AKI肾脏并在肾小管中蓄积。以人肾小管上皮细胞（human renal tubular epithelial cell,HK-2 cell）为模型细胞,通过H2O2刺激HK-2细胞构建氧化应激细胞模型,考察Ser-CS的细胞毒性和细胞摄取行为,结果表明Ser-CS具有低细胞毒性,可快速被损伤细胞摄取。免疫印迹法结果显示HK-2细胞经H2O2刺激后,KIM-1过度表达。采用共聚焦显微镜在细胞和组织水平上考察Ser-CS和KIM-1的免疫荧光共定位,结果显示Ser-CS和KIM-1荧光高度重合,表明H2O2刺激HK-2细胞对Ser-CS的优势摄取以及Ser-CS在AKI肾小管中的聚集和滞留与KIM-1介导的内吞有关。KIM-1在肾脏疾病的早期诊断和病理机制研究方面备受关注,而作为肾小管药物递送靶点,仍是一个新的研究领域。基于AKI损伤肾小管上皮细胞内的高ROS微环境,以ROS响应性的酮缩硫醇（thioketal,TK）键为连接键,通过酰胺反应将Ser-CS和活性肽类抗氧化药物SS31连接,合成了ROS响应性共轭物前药Ser-CS-TK-SS31。另外合成了非ROS响应性前药Ser-CS-壬二酸（nonane diacid,NO）-SS31和非KIM-1靶向性前药CS-TK-SS31作为对照。采用核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）图谱和凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography,GPC）对共轭物前药的结构进行确证并通过特征峰峰面积和分子量估算SS31接枝比,结果显示SS31在3种共轭物前药上的接枝比为1/1。采用HPLC考察Ser-CS-TK-SS31和CS-TK-SS31的载药量分别为16.8%和19.6%,由此计算得到SS31接枝比也为1/1,与NMR和GPC结果一致。H2O2是一种典型且相对稳定的ROS,将Ser-CS-TK-SS31在10 m M H2O2介质中孵育,采用HPLC检测其经时药物释放行为,结果显示Ser-CS-TK-SS31具有明显的ROS响应性药物释放特征,在H2O2条件下,Ser-CS-TK-SS31快速释放药物,8 h内SS31的释放量达到60%,而非响应性的SS31前药Ser-CS-NO-SS31与H2O2共孵育48 h,仍没有药物释放。另外,Ser-CS-TK-SS31具备良好的血浆稳定性,有利于药物在体内的有效递送。以H2O2刺激HK-2细胞构建氧化应激细胞模型,采用激光共聚焦显微镜观察Ser-CS-TK-SS31的细胞内药物释放和线粒体靶向性。结果显示随孵育时间的延长,Ser-CS-TK-SS31在氧化应激模型细胞中,其载体与药物的荧光信号显示出明显分离,而在正常细胞中荧光信号仍具有较高的重合度,表明Ser-CS-TK-SS31具有ROS响应性释放特征。释放的药物SS31可靶向分布于线粒体,发挥抗氧化应激作用。以SS31、CS-TK-SS31和Ser-CS-NO-SS31为对照,考察Ser-CS-TK-SS31的抗氧化应激和抗凋亡能力,结果表明,Ser-CS-TK-SS31相比对照组,可更有效地降低线粒体ROS水平,减少抗氧化酶HO-1的表达,稳定线粒体膜电位,减少细胞凋亡。以ICR小鼠为模型动物,采用双侧肾动脉夹闭法构建IR-AKI小鼠模型,对尾静脉注射Ser-CS-TK-SS31的IR-AKI治疗效果进行评价。结果显示,相比SS31、CS-TK-SS31和Ser-CS-NO-SS31对照组,Ser-CS-TK-SS31具有更佳的AKI治疗效果,显著降低AKI小鼠血肌酐和尿素氮水平,有效改善肾脏组织结构,减少肾小管透明管型和细胞脱落、保留刷状缘,有效减少线粒体的内外膜破裂、嵴缺失和肿胀,降低氧化应激标志物硝基酪氨酸的表达和氧化应激因子MDA水平,提高还原剂谷胱甘肽水平,减少炎症因子（IL-6和TNF-α）、巨噬细胞浸润和肾脏组织的细胞凋亡。采用HPLC考察AKI小鼠经尾静脉注射Ser-CS-TK-SS31后,其主要脏器中SS31的含量,结果显示SS31主要分布在小鼠肾脏中,表明Ser-CS-TK-SS31具有良好的肾脏聚集效应,这是其良好AKI治疗效果的重要原因。综上所述,本研究基于脓毒症诱导AKI的血管内皮氧化应激损伤和IR-AKI的肾小管上皮氧化应激损伤,以线粒体靶向抗氧化活性肽SS31为药物,构建了两种AKI肾靶向药物递送系统:HA/CS/SS31纳米复合物和Ser-CS-TK-SS31共轭物前药。这两种药物递送系统均可在血液循环中保护SS31免受降解和快速代谢,针对不同的靶点CD44和KIM-1,通过受体-配体特异性相互作用主动靶向递送SS31到达肾脏损伤细胞,并实现药物的可控释放,进而在线粒体靶向聚集,缓解氧化应激,最终实现SS31的AKI高效治疗。