具有特异性捕获磷酸化蛋白的色谱固定相在生物样品预处理过程中发挥了极其重要的作用。但是在对捕获的蛋白进行释放时,一般需要通过改变流动相的pH值或使用洗脱剂的方式实现。所用的流动相和洗脱剂常常是高浓度、极端pH值的盐溶液或是具有毒性的有机试剂。这些试剂极易破坏磷酸化蛋白的活性和结构,造成其重要的生物信息丢失。此外,切换流动相后色谱柱需要较长的时间才能恢复平衡,降低了实验效率。为了解决以上问题,我们将温度敏感材料引入到色谱固定相中,实现用水作为流动相,仅通过改变温度就能对磷酸化蛋白进行富集和释放。这种方法,克服了传统富集和释放方式的缺点,使磷酸化蛋白的分离过程安全化、简单化、绿色化。本研究基于可逆加成-断裂链转移聚合（RAFT）方法,通过利用具有优异温度敏感性能的聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）和对磷酸化蛋白具有高特异性结合能力的纳米TiO₂和Ti⁴⁺,制备了三种温度敏感亲和色谱材料:silica@pNIPAAm-nanoTiO₂、silica@p（NIPAAm-co-AMPA）-Ti⁴⁺和silica@p（NIPAAm-co-IPPA）-Ti⁴⁺,并将三种材料成功地应用于小分子磷酸化合物和磷酸化肽段的富集和分离中。具体研究内容包括以下方面:1.基于SI-RAFT法,通过快速引入官能团的方式合成了金属氧化物温度敏感亲和色谱材料silica@pNIPAAm-nanoTiO₂。通过红外和X-射线光电子能谱证明材料合成成功;通过热失重和差示量热法测得了材料的接枝率和最低临界温度,初步判断其具有合格的温度敏感性能。在测试性能前,对材料的接枝构象和流动相pH值进行了优化,发现当材料接枝率为10%-15%,接枝密度30%,流动相pH值为6时具有最佳的分离效果。最后,该材料成功实现对三磷酸腺苷和酪蛋白磷酸肽的捕获和释放,并成功应用于α-酪蛋白的胰蛋白酶解液中磷酸化肽段与非磷酸化肽段的初步分离。2.基于SI-RAFT法,通过快速引入官能团的方式合成了固定金属离子温度敏感亲和色谱材料silica@p（NIPAAm-co-AMPA）-Ti⁴⁺。通过红外和X-射线光电子能谱证明材料成功合成;通过热失重和差示量热法测得了材料的接枝率和最低临界温度,初步判断其具有较好的温度敏感性能。然后,对材料的接枝构象和流动相pH值进行了优化,发现当材料接枝率为20%-25%,接枝密度50%,流动相pH值为7时具有最佳的使用效果。最后,该材料成功实现对三磷酸腺苷的捕获和释放。值得一提的是,该材料能通过在线补充钛离子的方式延长使用寿命。3.基于SI-RAFT法,通过一步聚合法制备了固定金属离子温度敏感亲和色谱材料silica@p（NIPAAm-co-IPPA）-Ti⁴⁺。通过红外和X-射线光电子能谱证明材料制备成功。通过扫描电镜证明该合成路线能有效地保护硅胶形态。然后,对NIPAAm和IPPA的比例进行了优化,发现当IPPA占总摩尔数的15%时,该材料的捕获和释放效果最佳。最后,该材料成功实现了对酪蛋白磷酸肽的多次富集与分离,并成功应用于实际样品中磷酸化肽段的简单处理。