禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)能引起禽类的心包炎、肝周炎、腹膜炎、败血症等,近年来,脑膜炎型日益增多。APEC血清型多样,有O血清型176种,K型103种,H型83种,且耐药性严重,存在地区及品种差异,难以根除,给畜牧业带来严重危害,同时也是一种人畜共患病病原体。目前APEC的致病机理尚未完全弄清楚。本试验采用PCR、多重PCR及dot blot等方法对华东地区APEC鸭源株的系统进化群及所携带的毒力相关基因进行了调查,并对分离株DE205B侵袭相关基因ibeA进行序列分析、缺失等。2005—2007年间,从江苏、安徽、山东等华东地区送检的临床疑似大肠杆菌感染的病死鸭中,采集病料分离获得501株细菌。经糖发酵、尿素酶、IMViC等生化试验以及三糖铁琼脂培养试验,并经显色培养基验证,480株确定为大肠杆菌。表明禽源大肠杆菌病在华东地区鸭群中广泛存在,且鸭源APEC变得日益复杂,常见临床症状有心包炎、肝周炎、腹膜炎、关节炎等,其中有神经症状的分离株占74.17%(356/480)；从分离部位看,脑分离株32.08%(154/480),心脏分离株23.96%(115/480),肝脏分离株20.21%(97/480),脾脏、气囊和肾脏分离株分别为10.83%(52/480)、4.79%(23/480)、2.50%(12/480),其它部位也有分离到,与地区、种类、宿主等亦有很大相关性。为了揭示其遗传起源和分子特性,选用一种简便快速的分子分群方法,即通过扩增chuA和yiaA基因及TspE4.C2 DNA片段的三重PCR,对这些分离株进行了系统进化群的分析。在华东地区分离的480株鸭源APEC菌株中,A群占56.25%,B2群占19.17%,D群占16.46%,B1群占8.13%,对研究我国APEC的生态分布和遗传进化具有重要参考价值。设计并合成16对引物,用PCR及多重PCR方法对鸭源APEC的非侵袭相关的16个毒力基因,包括afa/draB、iha、papC、tsh、mat、chuA、fyuA、irp2、iucD、iutA、 iroN、iss、kpsMTII、traT、vat和malX进行检测,分析其在480株鸭源APEC中的分布。结果表明,在鸭源APEC中,除了kpsMTII全部阴性,其它均有不同程度的分布,即iutA 85.83%(412/480)、mat 83.13%(399/480)、iss 83.13%(399/480)、iroN 64.38%(309/480)、iucD 63.96%(307/480)、tsh52.71%(253/480)、traT47.71%(229/480)、 irp2 32.50%(153/480)、fyuA 27.92%(134/480)、chuA 27.29%(132/480)、iha 6.88% (33/480)、vat 3.13%(15/480)、papC 1.88%(9/480)、malX 1.04%(5/480)、afa/draB0.21%(1/480)；通过比较还发现16个毒力相关基因在480株鸭源APEC中共存在89种不同的分布模式,含1到13个基因不等,显示华东地区鸭源APEC分离株的毒力基因分布较为复杂。根据已发表的大肠杆菌侵袭相关基因序列设计并合成11对引物,用PCR及多重PCR方法检测480株鸭源APEC中11个侵袭相关基因片段的分布,包括fimC、sfa/focCD、cvi/cva、neuC、ompA、cnf1/2、hlyA、gtmB、ibeA、yijP和aslA,分析鸭源APEC的侵袭相关基因的分布特征。结果显示,在鸭源APEC中,除hlyA、cnf1/2和sfa/focCD全部阴性,其它均有不同程度的分布,即.vijP 94.38%(453/480)、ompA 91.25% (438/480)、fimC 80.00%(384/480)、cvi/cva 67.29%(323/480)、aslA 41.25%(198/480)、 ibeA 3.96%(19/480)、gimB和neuC均为1.67%(8/480)；比较还发现其存在30种不同的侵袭相关基因的分布模式,含1到7个基因不等,另有一株分离株不含任何侵袭相关基因。可见APEC侵袭相关基因的分布模式的多样化。为大批量检测禽源大肠杆菌病毒力基因,建立了斑点杂交法。将PCR扩增的ibeA的342bp的保守片段DNA测序验证后标记成地高辛探针,菌液样品直接在带正电荷的尼龙膜上裂解,杂交后用CSPD化学发光法检测靶基因。特异性试验表明,该探针仅与靶基因核酸反应。敏感性检测表明,膜上的最低检出量为1.0×103个大肠杆菌。PCR检测的480株鸭源APEC的菌液样品中,发现19株为ibeA阳性,用斑点杂交法重复三次检测上述样品,阳性率均为3.96%。证明建立的斑点杂交法具有特异、敏感和可重复的特点,可用于大量临床样品或菌液直接检测的初步筛选,尤其对临床症状不明显的大肠杆菌隐性感染的检出更具优势。鸭源APEC分离株DE205B在与新生儿脑膜炎大肠杆菌(Newborn meningitis-causing E. Coli,NMEC)RS218的系统进化群相同和含有的毒力相关基因相似的前提下,对其进行了溶血反应、致病性试验和体外感染猪脐静脉微血管内皮细胞(SUMECs)等相关特性的检测。结果发现,DE205B在绵羊血平板上呈β溶血；致病性试验显示,具有常见的大肠杆菌病症状,对小鼠和鸭的LD5o分别为3.97 x 106和1.05×107CFU/ml。且DE205B能够在SUMECs上进行生产性复制：琼脂糖凝胶电泳显示感染细胞的DNA呈“梯样”图谱；光镜下,可见感染细胞的形态发生特征性改变,细胞皱缩,表面微绒毛消失,胞浆内大量空泡出现,细胞核染色体发生浓缩；流式细胞仪检测出细胞在感染后出现凋亡；侵袭率为3.36%。克隆并分析APEC侵袭相关基因ibeA,探寻其变异与进化发生关系。根据已发表的NMEC株RS218的ibeA的核苷酸序列,设计合成一对引物,以鸭源APEC神经症状脑分离株DE205B基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增到ibeA的全基因序列,将检测正确的基因进行测序。结果显示DE205B的ibeA序列编码区为1371bp,编码456个氨基酸,分子量为49544.33dal。核苷酸序列比较表明,与已发表的ibeA基因核苷酸具有较高的同源性(98.9%以上),遗传进化分析显示与NMEC亲缘关系很近。将pKD46质粒电击转化APEC株DE205B, PCR扩增两翼与目的基因ibeA同源的卡那霉素抗性基因片段,电击转化DE205B/pKD46菌株,借助Red系统的重组功能,置换DE205B基因组中的ibeA基因,并通过导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20,去除抗性基因标志。对重组菌主要生物学特性的研究表明,ibeA基因缺失株生长能力稍慢于野生株,前6h差别不明显,7h后差别明显加大；仍可在绵羊血平板上发生β溶血；对SUMECs的侵袭率降为0.57%；对小鼠的毒力显著降低,其LDso大于108CFU/ml。用Red系统快速成功的获得了侵袭相关基因ibeA被完全敲除且不带卡那霉素抗性基因的大肠杆菌,为深入研究大肠杆菌减毒活疫苗奠定了基础。