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背景：我国食管癌死亡率居世界首位，主要为食管鳞癌，约占全部食管癌的95％左右。食管癌的总体疗效和预后较差，对人们健康造成极大危害。近年来国内外学者对食管鳞癌发病机制、早期诊断和治疗方法进行了大量研究。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)基因是目前国内外肿瘤基因调控研究中的热点，它是机体适应缺氧环境的关键调节因子，在恶性肿瘤的发生、发展中发挥着关键作用。国内外的多项研究表明HIF-1α在食管鳞癌中也呈高表达，且与肿瘤血管生成、转移和浸润密切相关。目的：利用RNA干扰技术沉默HIF-1α，构建稳定表达沉默HIF-1α的食管鳞癌Eca-109细胞株，分别体外、体内研究RNA干扰HIF-1α基因对人食管鳞癌细胞Eca-109的抑制效应。方法：1、用不同缺氧时间(0、12、24、48、72h)、不同浓度氯化钴(0、200、400、600、800μM)模拟缺氧培养食管鳞癌细胞Eca-109，以Western blot法检测细胞中HIF-1α蛋白的表达变化，选择可以引起HIF-1α蛋白表达增加的适当的氯化钴浓度和缺氧培养时间。2、选择四组细胞进行培养：1组为食管鳞癌细胞Eca-109，2-4组为RNA干扰HIF-1α基因后筛选出的稳定传代的3株细胞(分别为H2／14、H3／15、H2／20号细胞，由本实验室编号保存)，采用400μM氯化钴培养24h，以Western blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HIF-1α蛋白及mRNA表达，同时Western blot检测血红素加氧酶(hemeoxygenase-1，HO-1)、基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2，MMP-2)、葡萄糖转运体-1(glucosetransporter-1，GLUT-1)、p53等相关基因的表达，挑选抑制效果最好的细胞株。3、6周龄BALB／c裸鼠随机分为3组(每组10只)，并常规培养3组不同细胞，A组为食管鳞癌细胞Eca-109，B组为转染空质粒的食管鳞癌细胞Eca-109(Eca-109／Neo)，C组为稳定转染shRNA干扰HIF-1α食管鳞癌细胞Eca-109／shRNA，收集3组不同的细胞，分别注射于3组裸鼠肩背部皮下，观察移植瘤出现的时间，定期测量裸鼠体重，瘤体大小，计算肿瘤体积，肿瘤体积=(长径×短径~2)／2。28天后处死全部裸鼠，称取瘤体重量，计算抑瘤率，抑瘤率=(1-实验组瘤重／对照组瘤重)×100％。绘制肿瘤生长曲线。4、移植瘤提取组织蛋白，Western blot法检测HIF-1α，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，和凋亡抑制蛋白bcl-2、生存素(survivin)的表达。同时部分移植瘤采用免疫组化法检测凋亡相关基因bcl-2、bax、survivin和p21的表达，进一步观察HIF-1α基因与凋亡的关系。5、将培养的Eca-109和Eca-109／shRNA细胞在400μM氯化钴缺氧培养48h后用流式细胞仪检测细胞周期，并用Annexin V-PE／7-AAD试剂盒检测细胞凋亡率。了解mF-1α基因沉默后细胞周期的变化，了解抑制HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。结果：1、缺氧条件下HIF-1α蛋白在食管鳞癌细胞Eta-109中的表达在Eca-109细胞中HIF-1α蛋白表达随着氯化钴浓度的加大而增加，并且HIF-1α在缺氧后12 h明显升高，24 h后开始降低，48-72 h逐渐减少。结果显示400μM氯化钴浓度和培养24h是最佳实验条件，并选之为后续实验的浓度和时间。2、RNA干扰抑制HIF-1α后HIF-1αmRNA的表达4组细胞分别在常氧与400μM氯化钴处理24 h后RT-PCR检测，发现H3／15号细胞HIF-1αmRNA表达较少，但差异没有统计学意义(P＞0.05)。3、RNA干扰抑制HIF-1α后HIF-1α蛋白及其相关基因的表达4组细胞分别在常氧与400μM氯化钴处理24 h后Western-blot法检测，H3／15组细胞HIF-1α蛋白表达最少，与其它3组相比差异有统计学意义(P＜0.01)。干扰细胞常氧下HO-1、GLUT-1、MMP-2、p53表达比未干扰的Eca-109细胞有不同程度减少，400μM氯化钴处理24 h后HO-1、p53表达增加，MMP-2、GLUT-1表达无明显变化；综合比较，H3／15号细胞HIF-1αRNA干扰效果最好。4、裸鼠移植瘤体内实验结果细胞接种后1周左右即见A、B组的裸鼠皮下均出现移植瘤，成瘤率达100％；而C组约在2周左右才见肿瘤生长，成瘤率也达到100％，成瘤延迟，生长速度减慢。28天后移植瘤的体积和重量比较，C组相比两对照组差异具有统计学意义(P＜0.01)，抑瘤率达到70％。5、移植瘤中HIF-1α、VEGF和凋亡相关基因的表达Western blot检测蛋白表达，C组HIF-1α比两对照组明显减少，VEGF明显减少，bcl-2明显减少，survivin明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.01)。免疫组化检测显示C组bcl-2，survivin，p21比两对照组表达减少，bax表达增加。6、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率结果体外用400μM氯化钴缺氧48h后流式细胞仪检测Eca-109／shRNA细胞被明显阻滞在G2期。Annexin V双标显示缺氧后Eca-109／shRNA细胞凋亡率明显升高，比对照组差异有统计学意义(P＜0.01)。结论：1、HIF-1α蛋白表达与氯化钴模拟缺氧程度和时间有关，HIF-1αmRNA表达没有明显差异，提示氯化钴模拟缺氧诱导的HIF-1α调节可能发生在蛋白水平，而非转录水平。2、常氧及缺氧后挑选出H3／15细胞为RNA干扰效果最好的一株细胞，结果表明，H3／15细胞的HIF-1α蛋白表达也随着缺氧程度的加深而递增，说明RNA干扰技术只是对基因的抑制，而不是完全沉默。3、HO-1、MMP-2、GLUT-1均是HIF-1的靶基因。本研究中，食管癌细胞HIF-1α被抑制后HO-1、MMP-2、GLUT-1的表达也明显下调，提示抑制HIF-1α后可能会从抑制肿瘤血管生成，抑制细胞无氧糖酵解，抑制侵袭转移等方面抑制肿瘤的生长。4、干扰细胞的移植瘤成瘤延迟，生长减慢，可能通过抑制HIF-1α基因后抑制肿瘤血管生成和能量供应，抑制细胞分裂，促进细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长。