研究目的本研究拟研发一种新型红细胞血型抗体鉴定新技术,即利用体外红细胞膜抗原提取技术提取红细胞膜抗原,将提取的红细胞膜抗原偶联于微球上,制备成红细胞血型抗体芯片筛查并鉴定人血清中的红细胞血型抗体,克服现有红细胞血型抗体检测方法灵敏度低,无法实现检测标准化,试剂保存期短导致资源浪费及抗体漏检导致溶血性输血不良反应发生等缺陷,实现红细胞血型抗体的精准鉴定,确保输血安全和输血疗效。研究方法1.取压积红细胞,利用红细胞膜抗原体外提取技术进行红细胞膜抗原的提取,选择合适的磁微球与提取的红细胞膜抗原偶联,优化偶联比例,制备成血型抗体芯片;将芯片与抗体试剂或血浆标本进行反应,优化反应条件;完成芯片制备及反应条件优化后,对芯片的灵敏度、特异性、稳定性及重复性进行验证:1)将制备好的芯片对不同滴度的抗s和抗B抗体进行检测,并使用微柱凝胶法平行检测,计算并比较两种检测方法的最低检出限及动力学范围;2)使用BSA作为非目的抗原,对芯片的检测特异性进行验证;3)将红细胞膜保存两年前后分别制备成芯片,检测保存前后的信号值,验证红细胞膜抗原的稳定性;4)对同一批样本进行实验间及实验内重复性检测,比较实验内及实验间结果的变异系数CV值,验证芯片的重复性。2.我们采用红细胞血型抗体芯片对临床常用的15种血型抗体(抗C、E、c、e、Jka、Jkb、M、N、S、s、Fya、K、k、Lea、P1)进行检测,并与微柱凝胶法检测结果比较,利用凝集抑制实验对两种检测方法不一致结果进行验证,并对可能存在交叉反应的相应抗原进行基因分型,最后利用Blast软件对相似抗原进行同源性比对,分析交叉反应发生的可能原因。3.使用我们制备的红细胞血型抗体芯片,目前常用检测方法微柱凝胶法及玻璃珠微柱法对43例患者标本同时进行意外抗体检测,比较三种检测方法结果的一致性;在43例患者样本中选20例样本,利用红细胞血型抗体芯片进行重复性检测,比较两次检测结果的一致性。研究结果1.当红细胞膜抗原和微球的最适偶联比例为45μg/1.25×105,且反应条件为21℃孵育1h时可获得检测的最高信噪比(信号值与噪音值之比)。芯片法的最低检出限及动力学范围比微柱凝胶法高700倍左右,且红细胞血型抗体芯片只识别特异的抗原抗体反应,并不与其他非目的抗原之间存在交叉反应,具有良好的特异性。重复性结果显示实验内和实验间CV值分别为3.32%和4.34%,均在5%以内,说明红细胞血型抗体芯片检测具有很好的重复性。稳定性结果显示红细胞膜抗原保存两年前后检测信号值无差异,P=0.9487,说明红细胞膜抗原至少可保存2年。2.红细胞血型抗体芯片及微柱凝胶法对15种血型抗体检测结果显示,15种血型抗体中9种抗体(抗Lea、K、E、P1、N、Fya、M、s、k)使用两种方法检测结果一致,6种抗体(抗C、c、e、JKa、JKb、S)使用两种方法检测结果不一致,6种不一致的抗体利用凝集抑制实验进行检测,结果显示凝集抑制实验结果与红细胞血型抗体芯片结果一致。基因分型结果显示红细胞上不存在与检测抗体相匹配的抗原,但与相应抗原蛋白序列同源性在98.8%以上。3.红细胞血型抗体芯片、微柱凝胶法及玻璃珠微柱法三种方法对43例患者标本进行红细胞同种意外抗体检测,35/43(81.4%)三种检测方法检测结果一致,37/43(86.1%)微柱凝胶法和芯片法检测结果一致,41/43(90.7%)玻璃珠微柱法和芯片法检测结果一致,35/43(81.4%)玻璃珠微柱法和微柱凝胶法检测结果一致。其中21例阴性标本三种检测方法检测一致均检测为阴性,但22例阳性标本检测时出现不一致的结果,红细胞血型抗体芯片检测到22例阳性,微柱凝胶法检测到16例阳性,玻璃珠微柱法检测到18例阳性。结 论1.我们成功构建了基于液相芯片技术的红细胞血型抗体芯片,该芯片具有高灵敏度、高特异性、高通量、重复性好、保存期长等优点。2.目前某些常规使用的血型抗体试剂存在一定的交叉反应,且该交叉反应只有在灵敏度高的检测方法中才能被检测,因此红细胞血型抗体芯片在评价血型抗体试剂质量方面存在极大的优势。3.红细胞血型抗体芯片可用于红细胞意外抗体的鉴定,且可检测到目前常规检测方法(微柱凝胶法)漏检的弱抗体,可有效避免抗体漏检导致的溶血性输血不良反应的发生,进而确保输血安全有效。