目的1 补肺益肾组分方(Effective-component compatibility of Bufei Yishen formula,ECC-BYF)及其组分配伍干预作用评价:以慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)大鼠为研究对象,评价ECC-BYF及其组分配伍对COPD大鼠的干预作用特征,揭示其组分配伍规律。2ECC-BYF阻抑炎症反应机制探讨:以脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞炎症反应模型为研究对象,采用转录组学分析ECC-BYF阻抑炎症反应治疗COPD可能的作用机制。方法实验一228只SD大鼠随机分为正常组(Normal)、模型组(Model)、ECC-BYF组、补气组(Buqi Group,BQ)、补肾组(Bushen Group,BS)、化痰组(Huatan Group,HT)、活血组(Huoxie Group,HX)、扶正组(Fuzheng Group,FZ)、祛邪组(Quxie Group,QX)、补气化痰组(Buqi Huatan Group,BQHT)、补气活血组(Buqi Huoxie Group,BQHX)、补肾化痰组(Bushen Huatan Group,BSHT)、补肾活血组(Bushen Huoxie Group,BSHX)、扶正化痰组(Fuzheng Huatan Group,FZHT)、扶正活血组(Fuzheng Huoxue Group,FZHX)、补气祛邪组(Buqi Quxie Group,BQQX)、补肾祛邪组(Bushen Quxie Group,BSQX)、氨茶碱组(Aminophylline Group,APL)、乙酰半胱氨酸组(N-Acetylcysteine Group,NAC),共19组,每组12只。1至8周,采用香烟烟雾暴露联合反复细菌感染的方法复制COPD稳定期大鼠模型,9至16周,给予相应的药物灌胃,16周结束后取材。采用WBP全身体积描记系统及PFT测量系统测定肺功能;病理学技术观察肺组织病理及超微结构;对支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中细胞进行分类计数;ELISA法检测血清、BALF中白介素(Interleukin,IL)-1p、IL-6、肿瘤坏死因子(Tumornecrosis factor,TNF)-α等,BALF 中胶原蛋白(Collagen,COL)-1、COL-3、基质金属蛋白酶(Matrix metalloprotein,MMP)-9、MMP-12等,肺组织研磨液及 BALF 中黏蛋白 5AC(Mucin 5AC,MUC5AC)、水通道蛋白5(Aquaporins 5,AQP5)等,血清中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、组织因子(Tissue factor,TF)、血栓调节蛋白(Thrombomodulin,TM)等因子水平;比色法检测血清及肺组织研磨液中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、脂质过氧化物(Lipidperoxide,LPO)等氧化应激产物水平;流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚型。对各类指标进行Region(R)值综合评价,分析ECC-BYF及其组分配伍对COPD大鼠的治疗作用特点,揭示ECC-BYF组分配伍规律。实验二巨噬细胞分为空白组(Control)、LPS模型组(Model)及ECC-BYF不同浓度组,MTT法检测不同浓度ECC-BYF对细胞活性的影响。qPCR法检测不同浓度ECC-BYF对 IL-1β、IL-6、TNF-α、前列腺素-内过氧化物合酶 2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)mRNA表达的影响,筛选ECC-BYF合适浓度。将巨噬细胞分为Control、Model、ECC-BYF及不同组分配伍组(同实验一),qPCR法检测其对IL-1β、IL-6、TNF-α、PTGS2 mRNA表达的影响,筛选阻抑炎症反应最佳组分配伍,进行下一步实验。将巨噬细胞分为Control、Model、ECC-BYF、BSHT组,LPS作用24h后提取细胞总RNA,采用Illumina基因测序平台对各组细胞进行基因测序。分析各组细胞基因表达,筛选差异表达基因,对其进行GO富集和KEGG富集功能注释,获得富集基因及相关通路,分析ECC-BYF及BSHT组分配伍可能的阻抑炎症反应机制。结果实验一1对肺功能的影响模型组大鼠潮气量(Tidal Volume,VT)、呼气峰流速(Peak expiratory flow,PEF)、每分钟通气量(Minute Volume,MV)、用力肺活量(Forced vital capacity,FVC)、0.1秒用力呼气容积(Forced expiratory volume in 0.1s,FEV0.1)、0.3 秒用力呼气容积(FEV0.3)明显低于正常组(P<0.05,P<0.01);ECC-BYF组、氨茶碱组大鼠肺功能较模型组大鼠有明显改善(P<0.01)。2对肺组织病理的影响模型组大鼠肺组织镜下可见细支气管基底膜增厚、肺泡壁断裂融合、肺泡腔扩大、肺泡平均截距(mean linear intercept,MLI)显著增大(P<0.01),平均肺泡数(mean alveolar number,MAN)明显减少(P<0.01),并伴有大量炎性细胞浸润,呈肺气肿征象。与模型组比较,ECC-BYF组、氨茶碱组大鼠肺组织病理征象明显减轻(P<0.01)。超微结构方面,模型组大鼠肺组织呼吸膜明显增厚(P<0.01);肺泡Ⅱ型上皮细胞中板层小体数量减少,呈空泡化;线粒体数量减少、嵴模糊。ECC-BYF及除补肾组外的组分配伍组呼吸膜增厚情况缓解(P<0.05,P<0.01);线粒体及板层小体数量有所增加。3对炎症反应的影响BALF中炎性细胞数:与模型组比较,ECC-BYF、BSHT、BQQX组大鼠BALF细胞总数、中性粒及淋巴细胞比例显著降低(P<0.05,P<0.01);FZ、QX、FZHT组BALF细胞总数,BQ、BSHX、FZHX、BSQX组中性粒比例,BQ、FZHT、BSQX组淋巴细胞比例降低(P<0.05,P<0.01)。炎症因子水平:模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平较正常组显著升高,IL-10水平显著降低(P<0.01):BALF中TNF-α、IL-6水平显著升高(P<0.01)。不同组分配伍对各炎症因子效应不同,R值综合评价结果显示:不同组分配伍阻抑炎症因子的强度为:ECC-BYF、FZHX、BQHX、BQQX、BSHT、BSHX、BSQX(P<0.05,P<0.01)。4对蛋白酶/抗蛋白酶失衡的影响模型组大鼠血清、BALF中MMP-9、MMP-12,BALF中COL-1、COL-3水平较正常组显著升高,BALF中TIMP-1水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。R值综合评价结果显示:ECC-BYF、HX、FZ、FZHT、BQQX、BSQX调节蛋白酶/抗蛋白酶失衡及胶原沉积疗效显著(P<0.05,P<0.01)。5对氧化应激的影响模型组大鼠血清及肺组织MDA、LPO水平较正常组显著上升(P<0.01)。各指标R值综合评价结果显示:ECC-BYF、HT、FZ、BQHT可显著调节氧化/抗氧化失衡(P<0.05,P<0.01)。6对黏液分泌的影响模型组大鼠BALF中MUC5AC、AQP5及肺组织中MUC5AC水平较正常组显著增加(P<0.01)。R值综合评价结果显示:ECC-BYF、BSHT、BQHX、APL、NAC抑制黏液高分泌效果显著(P<0.05,P<0.01)。7对内皮损伤/修复的影响模型组大鼠血清TF、VEGF水平显著升高,TM水平较正常组显著降低(P<0.01)。R值综合评价结果显示:ECC-BYF、HX、FZ、BSHX、BQQX在调节内皮损伤/修复效果显著(P<0.05,P<0.01)。8对T淋巴细胞表型的影响模型组大鼠血液CD4+、CD8+细胞数及CD4+/CD8+比例较正常组显著降低(P<0.01)。与Model比较,BYF、FZ、BS、BSHT、BSHX组大鼠血液CD4+、CD8+细胞数显著增多(P<0.05,P<0.01);BQHT、BQHX、FZHT、APL 组 CD4+细胞数,HT 组 CD8+细胞数及 ECC-BYF、BQ、BQHT、BQHX、FZHT、BQQX、APL 组 CD4+/CD8+比例显著降低(P<0.05,P<0.01)。实验二1 ECC-BYF及其组分配对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应的影响ECC-BYF可显著降低LPS诱导的巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和PTGS2 mRNA表达,160 μg/mL效果较好;BSHT显著降低IL-1β、PTGS2 mRNA表达,BQHT可显著降低 IL-1β、TNF-α、PTGS2 mRNA 表达,BQQX、BSQX 配伍可显著降低 IL-1β、IL-6、PTGS2mRNA 表达(P<0.01)。2 ECC-BYF及BSHT组分对LPS诱导的巨噬细胞基因表达的影响差异表达基因水平分析结果显示,空白组与模型组比较,差异表达基因中上调780个,下调677个;ECC-BYF与模型组比较,差异表达基因上调235个,下调276个;BSHT与模型组比较,差异表达基因上调99个,下调144个。ECC-BYF可调节LPS诱导的巨噬细胞186个基因,BSHT配伍可调节LPS诱导的巨噬细胞110个基因。GO富集分析各组细胞差异表达基因结果显示:空白组与模型组差异表达的基因富集于575个GO条目中,主要包括炎症反应、固有免疫反应、细胞内信号转导及细胞组分等。ECC-BYF与Model差异表达的基因富集于279个GO条目中,主要包括炎症反应、细胞因子介导的信号通路、免疫反应及细胞组分等。BSHT与Model差异表达的基因富集于111个GO条目中,主要包括炎症反应、免疫系统进程及细胞组分等。KEGG通路富集结果显示:空白组与模型组差异表达基因富集于TNF信号通路、NF-κB通路、细胞因子受体相互作用通路等63条通路中;ECC-BYF与Model差异表达基因富集于Toll样受体、细胞因子受体相互作用通路、TNF信号通路等24条通路中;BSHT与ECC-BYF差异表达基因富集于Toll样受体、MAPK通路、细胞因子受体相互作用通路等14条通路中。富集通路多与炎症反应及免疫反应有关。结论1补肺益肾组分方及其组分配伍对COPD大鼠不同药效指标有不同的作用特点。含淫羊藿苷的组分配伍阻抑炎症反应效果显著;含人参皂苷Rh1和黄芪甲苷的组分配伍调节氧化/抗氧化失衡作用显著;含丹皮酚的组分配伍调节血管损伤/修复效果显著;FZHT、HX、FZ、BQQX、BSQX组分配伍调节蛋白酶/抗蛋白酶失衡及胶原沉积效果显著;ECC-BYF、BSHT、BQHX配伍抑制黏液高分泌效果显著;FZHT、ECC-BYF、BQHT配伍调节T淋巴细胞表型疗效较好。2 ECC-BYF、BSQX、BSHT、BQQX对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应有显著抑制作用;ECC-BYF和BSHT阻抑其炎症反应可能与调控TNF介导的信号通路、NF-κB、细胞因子受体相互作用通路有关。